作者：赵雁林,逄宇
出版社：人民卫生出版社
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结核病实验室检验规程试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
结核病实验室检验规程／赵雁林，逄宇主编.—北京：人民卫生出版社，2015
ISBN 978-7-117-20769-0
Ⅰ.①结… Ⅱ.①赵…②逄… Ⅲ.①结核病－医学检验－规程 Ⅳ.①R520.4－65
中国版本图书馆CIP数据核字（2015）第100934号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
版权所有，侵权必究！结核病实验室检验规程
主 编：赵雁林 逄 宇出版发行：人民卫生出版社有限公司
人民卫生电子音像出版社有限公司地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号邮 编：100021E - mail：ipmph@pmph.com制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司制作时间：2018年1月版 本 号：V1.0格 式：mobi标准书号：ISBN 978-7-117-20769-0策划编辑：王缔责任编辑：王缔打击盗版举报电话：010-59787491 E-mail：WQ@pmph.com注：本电子书不包含增值服务内容，如需阅览，可购买正版纸质图书。编写委员会
主 审 庄玉辉 潘毓萱主 编 赵雁林 逄 宇
副主编 夏 辉 宋媛媛 周 杨 郑 扬编 委（以姓氏笔画为序）
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夏 辉 柴 琦 钱 明 徐东芳 徐英春 朗 珍
措 姆 黄海荣 梅 建 崔振玲 符彩云 梁庆福
斯 琴 蒋 毅 蒋明霞 鲁 洁 鲁辛辛 蓝如束
谭云洪 谭耀驹序
规程，即为实现特定的检验检测目标而采取的一系列前后相继的行动组合，也即多个活动组成的工作程序。其中，科学制订、严格执行标准化操作规程，是保证实验诊断结果稳定，准确可靠的关键因素。我国各地结核病实验室在规模大小和水平上，尽管参差不齐，但是，都从多方面努力改进提高。这种提高当然也得益于1995年11月，中国防痨协会基础专业委员会编著了《结核病诊断细菌学检验规程》一书。随着结核病检验诊断技术方法的不断发展，该委员会又于2006年1月修订出版《结核病诊断实验室检验规程》。十几年来，在全国各级结核病专科医院与结核病防治机构以及各级综合医院中被广泛应用。从发表的论文中看出，作为标准方法被广泛引证。但是，自2006年以来，伴随着对结核分枝杆菌分子生物学及相关领域的研究不断深入，特别是基于分子生物学检测的结核诊断产品为数不少。第2版规程已经不能完全满足结核病实验室工作需要。为此，2013年，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心副主任、国家参比实验室主任赵雁林研究员率领组织结核界众多专家编著《结核病实验室检验规程》。在策划、拟定专著写作框架、审查初稿、定稿中，团结协作，集思广益，保证该书顺利完成。本专著分别从实验室人力资源、用房与功能分区、标本采集及保存、分枝杆菌保藏和管理、传统细菌学方法、分子生物学方法、生物安全等相关事宜做了系统的介绍。并且进行纵横向相互关系的协调设计，内容具有新颖性和较强的实用性，是一本重要的参考书。
2013年7月世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布了稍早前至近期的结核病诊断技术研究进展和评估状况：不同类型的诊断产品计28项，分为上市、评价、认可（或不）、推荐（或不）。我国近几年研制开发结核病实验诊断产品（试剂、仪器等），约有23项（个、台、件）之多获得医疗器械注册证书。本专著系统地介绍了包括国内外传统的及新的实验诊断技术方法。在实践中，各级结核病实验室因等级和条件不同，如何合理地选用符合实际的实验诊断技术项目，本人有几点建议供同道们参考：
首先，WHO曾提出，试剂（盒）获得医疗器械注册证书后在正式上市用于临床诊疗之前，拟通过多中心、大样本的临床实践验证、评估。以便比起前期的临床试验更能了解、评估两者的相互关系与符合率。从中选出若干项甚至更多的已获得认可的实验诊断产品。这样，有利于提高检验检测的准确率，也有利于推荐上市，用起来也更有把握，进而为临床诊疗服务。
其次，紧紧围绕着实验诊断“早期快速、操作简便、价格便宜、准确可靠、适于推广”目标的总要求，在国家结核病预防控制中心统筹下，结合实际选用符合不同等级实验室的实验诊断技术项目。
最后，由于结核病病原菌生物学特性和结核病诊断与鉴别诊断的特点，如，约有70%为菌阴肺结核、还有少数非结核分枝杆菌肺病及肺外结核。若用单一的生物标志物或试剂，时常会出现检测的敏感度、特异度高低不一的现象。拟改变研究或实验诊断的策略，如用两种或两种以上联合或先后检测，力求获得敏感度、特异度更合理的结果。又如，先用显示各自不同优势的液体培养技术，择时用分子生物学或其他诊断技术做快速检测、药物敏感试验等。检测结果表明，这样做既缩短了检验结果报告的时间，也因液体培养增菌又能提高检测的阳性率。
本专著是全国结核病预防控制工作人员，特别是各级实验室检验人员的重要参考书，也适用于全国广大医护人员、检验人员以及相关科研工作人员参考应用。期待着专著的正式出版能带动全国结核病实验室操作规程标准化的深入开展，促进全国结核病实验室标准化操作水平以及检验技术人员的素质不断提高。解放军第309医院庄玉辉研究员2015年3月24日于北京前 言
近年来，检验医学得到了飞速发展，许多基础医学领域的成果通过检验医学的桥梁成功转化到了临床应用工作中，结核病实验室诊断新技术不断涌现，适宜的新技术应用需要良好的筛选、验证和评估，并确保其在临床诊治中提供有质量保证的临床服务，质量是实验室的生命，遵循标准化的操作规程是实验室各项检验活动质量保证中所不可或缺的重要环节，本书在2005版《结核病实验室操作规程》的基础上增补了近年来市场可得的实验室检查和基因分型等方法，并结合国家结核病防治规划的需要增补了一些新型实验室诊断技术，按照实验室质量保证和国家对实验室生物安全的要求增添了相应章节。本规程从标本采集到标本保存和运送，从标本前处理到结果报告，以期对实验室检验操作前、中和后，以及人、机、料、法和环各个环节进行标准化和规范化，以利于结核病实验室在国家结核病防治规划中更好地发挥作用。
本书参考了我国临床检验相关操作规程、实验室认证认可相关内容，并结合世界卫生组织、美国临床实验室标准委员会等国际权威学术组织的文献资料，组织国内相关领域的专家们一起编写，在本书的编写过程中不仅得到了国内众多综合医院和结核病专科医院同道们的鼎力支持，而且也得到了中国合格评定国家认可委员会王荣老师、国家临床检验中心郭健和蔡剑平老师、中国防痨协会及中华医学会结核病学分会专家们的帮助和指导，然而限于编者的专业水平，错误在所难免，我们热忱欢迎临床医务人员和业内人士对本规程提出中肯的意见，以利于改进结核病实验室服务工作。编者2015年春于北京第一章 结核病实验室基本要求第一节 总 则
1.结核病实验室提供的检验服务应满足临床和结核病预防控制工作的需要。
2.保证结核病实验室检验工作客观、公正，不受任何部门、经济利益等影响。
3.结核病实验室应集中设置，统一管理，资源共享。
4.结核病实验室所在机构应当保证与其检验工作相适应的专业技术人员、场所、设施、设备等条件。
5.结核病实验室应建立健全并严格执行各项规章制度，严格遵守相关技术规范和标准，保证实验室检验质量。
6.按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等有关规定严格管理，建立并严格遵守生物安全管理制度与安全操作规程。
7.结核病实验室应按照生物安全防护级别配备必要的安全设备和个人防护用品，保证实验室工作人员能够正确使用。
8.对结核病实验室工作人员进行岗前培训和安全教育，持证上岗。每年进行生物安全防护知识培训。
9.病原微生物样本的采集、运输、储存严格按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等有关规定执行。
10.结核病实验室应按照有关规定加强生物安全和感染控制工作，妥善处理医疗废弃物。第二节 结核病实验室设置要求一、涂片实验室基本要求
1.涂片显微镜检查实验室应具备一个独立房间，分区（涂片区、染色区和读片镜检区）与布局应该符合生物安全防护的基本要求。
2.实验室门应有可视窗并可锁闭，门锁及门的开启方向应不妨碍室内人员逃生。
3.在实验室门口处应设挂衣装置，个人服装与实验室工作服分开放置。
4.实验室有上下水及电的供应，在靠近实验室出口处设非接触式洗手池。
5.实验室墙壁、天花板和地面应易清洁、不渗水、耐化学品和消毒灭菌剂的腐蚀，地面应平整、防滑。
6.在实验室工作时，应穿防护服、戴防护口罩和手套等个人防护用品。
7.实验室台、柜等摆放应便于清洁，实验台面应防水、耐腐蚀、耐热和坚固。
8.应根据工作性质和工作流程合理摆放实验室设备、台柜、物品等，避免相互干扰、交叉污染，并应不妨碍逃生和急救。
9.实验室可以利用自然通风，可开启的窗户应安装纱窗。如果采用机械通风，应避免交叉污染。
10.实验室内应保证操作时的照明，避免不必要的反光和闪光。
11.实验室应有Ⅱ级及以上生物安全柜、高压蒸气灭菌器、紫外灯等适当设备和有效消毒剂。
12.实验室应配备开展涂片检查所需要的仪器设备。二、分离培养实验室基本要求
在满足涂片实验室的基本要求上，还需满足以下要求：
1.分枝杆菌分离培养实验室应满足国家生物安全Ⅱ级（BSL－Ⅱ）及以上实验室的基本要求。
2.实验室主入口的门、放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭，实验室主入口的门应该标有国际通用的生物危害警告标志，未经批准的人员不可进入实验室工作区域。
3.实验室有上下水及电的供应，在靠近实验室的出口处设置洗眼器和感应式洗手池。
4.实验室内应配备Ⅱ级及以上生物安全柜、高压蒸气灭菌器以及分离培养所需的仪器设备。三、药物敏感性试验实验室基本要求
在满足分离培养实验室的基本要求上，还需满足以下要求：
1.药物敏感性试验实验室应满足国家生物安全Ⅱ级（BSL－Ⅱ）及以上实验室的基本要求。
2.实验室主入口的门、放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭，实验室主入口的门应该标有国际通用的生物危害警告标志，未经批准的人员不可进入实验室工作区域。
3.实验室内应配备Ⅱ级及以上生物安全柜、高压蒸气灭菌器以及药敏试验所需的仪器设备。
4.在实验室工作时，应穿防护服、隔离衣，戴防护口罩（面具）和手套等个人防护用品。
5.实验室宜采用机械通风控制气流，避免交叉污染。四、基因扩增检验实验室基本要求
1.结核分枝杆菌基因扩增检验实验室应当设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的；根据使用仪器的功能，区域可适当合并，例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。
2.基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。
3.进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。
4.各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。
5.不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
6.实验室的清洁应当按试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
7.工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。
8.实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》。
9.开展临床基因扩增的结核病实验室设置、审核和质量管理严格按《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》执行。第三节 实验室生物安全管理要求一、实验室环境安全
1.根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《人间传染的病原微生物名录》和《医疗机构临床实验室管理办法》的要求，对结核分枝杆菌大量活菌操作须在符合生物安全Ⅲ级（BSL－Ⅲ）的环境中进行；对样本检测（包括涂片、显微镜观察、样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取等初步检测活动）可以在符合生物安全Ⅱ级（BSL－Ⅱ）的环境中进行。
2.实验室所用设施、设备和材料（含防护屏障）均应符合国家相关的标准和要求。二、组织机构与制度管理
1.实验室所在单位应成立实验室生物安全委员会，法人代表必须为生物安全委员会负责人，实验室负责人必须是生物安全委员会成员。
2.根据本实验室的工作需要、实验室工作类型以及本地的情况，生物安全委员会制订完整的安全政策、安全手册，以及执行安全手册的支持程序、制订意外事故处理方案等，并监督实施。
3.实验室中管理制度必须包括准入制度、个人防护制度、标本接收制度、废弃物处理制度、意外事故处理预案、生物安全培训制度、生物安全自查制度、废弃物处理制度、仪器维护维修制度等。三、实验室操作
1.实验室应制订各种试验操作和仪器设备操作的标准化操作程序。
2.实验员必须接受相关专业知识和操作技能的培训才能进行试验操作。
3.受过相关培训的实验员操作时，必须符合标准化操作程序。
4.负责生物安全管理的人员，有责任制止不规范操作，以及处理意外事故。
5.具有相关专业知识和操作技能的工作人员进行实验室操作，实验人员应该认真负责，严格按照标准化、规范化的操作程序进行各项实验室操作。四、菌种或样本运输安全
为保障人体健康和公共卫生安全，在运输可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理。五、医疗废弃物处理安全
为了防止疾病传播，保护环境，保障人体健康，医疗废弃物的处理应该严格按照《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》以及《医疗废物管理条例》的相关规定妥善处理医疗废物。第四节 实验室质量保证一、室内质量控制（QC）
1.制订适合本实验室的标准化操作手册，并严格执行。
2.实验人员经过培训持证上岗。
3.实验室人员、设备、房间相对固定。
4.配制试剂和商品化试剂要有相关记录、确保在有效期内使用。
5.使用的仪器需要有使用、检测、维修等记录。
6.所有原始实验记录必须装订成册并单独存档保存，如有条件应同时保存电子版，定期进行数据统计分析。二、室间质量评估（EQA）
按照国家结核病参比实验室和国家临床检验中心的管理要求，通过实验室现场评价、盲法复检和批量测试等开展质量保证工作。三、质量提高（QI）
通过做好室内质量控制和室间质量控制达到质量持续改进。第二章 结核病实验室样本采集和保存
正确的标本采集、运送、保存和处理对于保证结核病实验室的工作质量至关重要，应予高度重视。实验室有责任将标本选择（包括时间和解剖部位）、收集、保存、运送、接受和安全等关键信息。本章表述用于结核杆菌检测的痰标本，支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、血液、大便标本等的采集、保存及运送，适用于各级结核病实验室开展抗酸杆菌涂片镜检、分枝杆菌的分离培养、分枝杆菌菌种鉴定、结核抗体检测、IFN－γ释放试验（IGRAs）检测、核酸检测、耐药检测。第一节 样本采集的要求一、标本要求（一）病人准备
1.实验室应编制详细的正确采集和处理原始标本的专用指导书，供采集原始标本者使用。
2.根据检验申请单检验项目的要求，确认采样计划并进行适当的准备工作：制订标本唯一性编码、选择合适的标本容器、指导病人做好采样前的准备工作等。采集标本前应认真核对病人、标本容器和检验申请是否一致，严防差错。（二）标本类型
1.痰标本、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本可用于抗酸杆菌涂片镜检。
2.痰标本、支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、血液、大便标本可用于分枝杆菌分离培养和结核分枝杆菌的核酸检测。
3.抗酸杆菌涂片阳性痰标本或临床分枝杆菌分离培养物可用于基于分子生物学方法开展的分枝杆菌分子菌种鉴定和结核分枝杆菌耐药基因检测。
4.结核杆菌涂片阳性痰标本、临床分离结核杆菌纯培养物可用于结核分枝杆菌药物敏感性试验。
5.血清可用于结核抗体的检测。
6.肝素锂或钠抗凝血可用于IFN－γ释放试验（IGRAs）检测。（三）标本的采集
用于分枝杆菌培养的标本：采集后如1小时内不能运送到实验室，除血液标本外，其他标本应4℃保存。实验室收到标本后，如不能及时处理，仍需冰箱冷藏，标本采集到接种时间间隔不能超过7天。（四）标本处理、储存与稳定性
1.痰标本（1）可疑肺结核患者：
初诊病人应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰），治疗中或随访病人应按期留取2份痰标本（晨痰、夜间痰），体积3～5ml，盛于广口和具有螺旋盖子的痰瓶中。不推荐实验室接收合并的痰标本和留取时间超过24小时的痰标本。（2）即时痰采集后立即送检：
夜间痰和晨痰采集后常温保存不应超过12小时，对当日不能进行涂片检查的标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。（3）对无法咳痰的患者：
可使用高渗盐水（3%NaCl）诱导痰或收集清晨胃液标本，或使用支气管镜采集支气管灌洗液标本。
2.支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本（1）对于不能留取痰标本的患者：推荐使用侵入性采集技术获取标本，比如纤维支气管镜检查、细针肺穿刺、肺活组织检查。（2）严格器械清洁和消毒，避免引起交叉污染和感染。（3）支气管镜不能接触自来水，避免污染环境分枝杆菌。（4）对难以诊断的病例推荐使用其他侵入性技术采集标本，比如细针穿刺、开放肺活组织检查，无菌条件下采集的经支气管活检和其他活检标本，运输过程中，应加入0.5～1ml无菌0.9%的生理盐水。
3.胃灌洗液（1）婴幼儿、儿童和迟钝者诊断肺结核时，鉴于无法采集痰标本或支气管灌洗液，推荐采集胃液标本，通过胃灌洗吸出咽下去的痰液。（2）标本应在采集后4小时内送到实验室，否则实验室应该提供一次性内含100mg碳酸钠的无菌容器。实验室不应接受未经中和的胃液标本。
4.尿液（1）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要40ml。（2）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。（3）实验室收到标本后，应立即处理或离心冷藏贮存尿沉渣。
5.无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、骨髓）（1）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标本于无菌容器。为防止标本凝固，体液标本中应加入灭菌草酸钾（每毫升体液加0.01～0.02ml 10%的中性草酸盐），或肝素（每毫升体液加0.2mg肝素），或柠檬酸钠（每10ml的体液加2滴20%的柠檬酸钠）。（2）推荐标本床边接种至分枝杆菌液体培养基中。（3）标本尽可能快的运送到实验室。
6.无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本）（1）采集标本尽可能无菌操作，放置到无固定剂或防腐剂的无菌容器中，不能浸泡在盐水或其他液体或用纱布包裹，重量不少于1g。应迅速运送到实验室，对于长时间的运输，为防止脱水可加入无菌盐水，保持温度在4～15℃。（2）针对皮肤溃疡，宜从病变组织周边采集活检标本，应在30℃和37℃不同条件下进行培养。（3）福尔马林溶液浸泡过的标本不能用于涂片和培养检查。（4）极少量的活检标本可以浸泡在少量无菌盐溶液中。
7.脓肿物、穿刺脓液、创伤标本
对于皮肤溃疡，应该从感染性皮肤周边下层抽吸标本。这种标本用于做分枝杆菌培养时，推荐在常规37℃条件培养外，增加在30℃条件下培养。
8.血液（1）如果血液标本接种培养基之前需要运输，磺酸钠、肝素或柠檬酸盐可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能用于做培养。（2）不推荐血液标本直接接种至固体培养基上。（3）血液和脑脊液标本培养推荐使用MYCO／FLYTIC瓶（BD）或MB／BactT ALERT血培养瓶。
9.大便标本（1）合并AIDS的胃肠道患者，推荐采集大便标本和其他部位采集的标本一起，用于检测鸟－胞内分枝杆菌复合菌群（Mycobacterium avium intracellular complex，MAC）。标本量＞1g。（2）大便标本涂片的敏感性只有32%～34%，不能根据涂片的结果决定是否进行培养。（五）标本量
1.痰标本应足量，且满足质量要求。
2.支气管分泌物至少2～5ml；支气管肺泡灌洗液至少20～50ml。
3.胃灌洗液需连续采集3天，体积5～10ml，调节pH至中性。
4.推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用于培养的尿液标本至少需要40ml。
5.应提交足够量的样本，脑脊液＞5ml，胸水和腹水5～10ml。
6.采集标本尽可能无菌操作，重量不少于1g。
7.无菌穿刺采集尽可能多的脓肿物、穿刺脓液、创伤标本。
8.血液标本量5～10ml。
9.大便标本的标本量＞1g。（六）不可接受样本
1.不推荐实验室接收合并的痰标本和留取时间超过24小时的痰标本。
2.实验室不应接受未经中和的胃液标本。
3.24小时全尿或者量不足的尿液标本（除非不能获得足够量的标本）属于不合格标本。（七）标本的运送
1.采集后无论运送距离远近都应按要求进行包装和标识。随标本应附有与标本唯一性编码对应的送检单。送检单应与送检标本容器分开，应含有受检者姓名、样本种类等信息。
2.运送过程要按照相关要求的温度范围内运送，并使用指定的保存剂。要注意容器的密封性以保证样本的完整性，必要时应避光或保湿。
3.运输病原微生物标本时，运送方式要遵守国家、区域和地方法规的要求，确保对运送者、公众及接收实验室的安全。（1）机构内部科室间标本运输：为防止发生意外渗漏或溢出，运输感染性物质时，应使用金属的或塑料材质的第二层容器（如盒子）加以包裹，在第二层容器中应该有标本容器的支架，将标本容器固定在支架上，以使其保持直立。第二层容器应耐高压或者能抵抗化学消毒的腐蚀，以便定期清除污染。封口处最好有一个垫圈，以防止发生渗漏。（2）跨机构之间的标本运输：应遵照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定执行。在运输过程中，运输的感染性物质分为A类和B类两大类。结核杆菌培养属于A类，对于陆路运输，结核杆菌培养用于临床诊断或评价疗效为目的，可以视为B类。陆路运输每个包装没有最大量的限制。（八）样本的接收
1.实验室应设置单独的标本接收处。工作人员应穿戴符合生物安全防护水平相适应的个人防护用品（包括隔离衣、帽、口罩、手套等）。
2.应由检验人员或经培训合格的专人验收，在接收记录簿、计算机或其他实验室信息系统（LIS）中对收到的所有原始样本进行记录，记录收到的日期和时间以及接收者。
3.应制订有关接收标本的标准。接收标本时，确认标本标记清晰并附有相应的化验单，两者信息必须一致。应认真核对，包括标本的类型、质量、体积、检查项目、标本采集和运送是否合乎要求等，标本送检人员和标本接收人员都要做认真的记录并签字存档。
4.应制订有关拒收样本的标准。如接收了不合格的原始样本，应在其最终的报告中说明样本不合格的原因，并在检验结果解释中予以说明。第二节 痰 标 本
痰标本检查是肺结核病诊断及疗效观察的主要手段，而痰标本的质量好坏直接影响检出结果。病人在医生的指导下，采取正确的方法采集痰标本，是实验室检查的保障。一、标本要求
可采用世界卫生组织（WHO）推荐的国际通用螺旋盖痰瓶（见图2－1），或可密封塑料盒收集痰标本（参考规格：直径4cm，高度2cm）。痰容器应标明患者姓名、编号（如初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和容器序号1、2、3（1＝当日即时痰，2＝夜间痰，3＝次日晨痰。）图2－1 痰瓶
1.标本类型
根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：（1）即时痰：
就诊时深呼吸后咳出的痰液。（2）晨痰：
患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。（3）夜间痰：
送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。
2.标本采集（1）收集方法：
深吸气2～3次，每次用力呼出；从肺部深处咳出痰，将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，拧紧盒盖。（2）采集地点：
采集痰标本时应在远离人群的开放空间，或通风良好的留痰室内进行。留痰室应与其他场所进行物理隔离，装备外排风装置、紫外线灯和洗手设施等。
3.标本储存与标本稳定性
痰标本收集后应该尽快送检，如果不能立即送检，应将标本置于4℃下冷藏；实验室收到标本后，应尽快完成实验操作，避免污染菌大量繁殖。若开展涂片染色显微镜检查，尽量在24小时内进行；若开展分离培养，痰标本尽量在4℃下冷藏，3天内（最迟不超过7天）进行培养操作；若开展其他分子生物检测，可在－20℃以下长期保存备用。
4.标本运输
若需要在机构之间进行痰标本运送的，运输单位或机构应按照国家规定取得相关许可，使用符合生物安全的标本运送箱进行冷藏运送。包装含以下三层：（1）初始包装（即装痰的容器）：
标本容器外需附有足够的吸附材料以吸附可能的泄漏所产生的所有液体。（2）第二层包装：
耐用的、防水的、防泄漏的包装以封闭和保护初始包装。几个分开的初始包装可以放在同一个二层包装内，但是必须有足够的吸附材料以吸附发生泄漏时的所有液体。（3）外包装：
第二层包装应该放在外层包装内，并有合适的垫子。外层包装保护内容物免受外界的影响，如运输时的物理损坏。对于地面运输，没有最大包装量的要求。冰袋应该放在第二层包装外边，而且保证冰袋防泄漏。
5.标本量（1）初诊患者：
应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰、次日晨痰）。（2）随访患者：
应按期留取2份标本（晨痰、即时痰）。
6.标本性状（1）干酪痰：
标本外观以黄色或奶酪色、脓样、团块状的肺部分泌物为主，黏度较黏液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故抗酸杆菌检出率较高。（2）血痰：
此类标本是在黏液痰或干酪痰标本中混有血液，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到黏液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰抗酸染色镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血部分。（3）黏液痰：
标本外观以白色、黏稠度较高的肺部和支气管分泌物为主；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的抗酸杆菌检出率较唾液高。（4）唾液：
目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、黏度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行抗酸杆菌检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。
7.不可接受样本
唾液进行抗酸杆菌检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。二、注意事项
如果患者刚吃过东西，应先用清水漱口再留取痰标本。患者留取的痰标本，标本量一般在3～5ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、黏液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应在医生进一步指导后重新送检。无痰患者可采用雾化引痰或鼻咽拭子采集标本。进行分离培养的痰标本应尽量在未应用抗结核药物之前采集，治疗中的病人要停药2天后再采集标本。第三节 其他类型标本一、咽拭子
采用消毒的棉棒，取样后加入几滴0.9%灭菌生理盐水，保持拭子的湿润避免干燥，尽快处理接种。二、脓液、创伤感染及手术切除组织标本
对于开放性感染，先用无菌生理盐水冲洗患部表面，以无菌拭子取脓液或病灶深部的分泌物；闭锁性脓肿采取穿刺或引流的分泌物。感染部位的切除组织标本，需研磨后进行去污染处理。棉拭子取样后加入灭菌生理盐水避免干燥，尽快处理接种。三、无菌采集标本
血液及骨髓、脊髓液、心包积液、滑膜液、腹水等穿刺液，应避免中间环节污染杂菌，直接接种。
1.所有液体标本应该在无菌的玻璃容器收集，不加任何防腐剂。
2.脑脊液最适的体积至少3ml，血液5～10ml，胆汁及其他穿刺液至少1ml。
3.标本必须立即送到实验室并尽早处理，或者预先加入无菌肝素抗凝（血液枸橼酸盐抗凝）短时保存在2～6℃。
4.收到标本后应直接接种在液体管中，进行培养。四、尿液、精液、前列腺液
尿液标本应该是清晨中段尿，收集在广口灭菌容器中，至少200ml。精液、前列腺液不加任何添加剂。参考文献
1.Patrick R.Murray.Manual of Clinical Microbiology 9th ed.washingtong，D.C.：ASM press，2007.
2.European Center for Disease Prevention and Control.Mastering the basics of TB control：Development of a handbook on TB diagnostic methods.Stockholm：ECDC，2011.
3.叶英妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006.
4.中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京：中国教育文化出版社，2006.
5.可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定.卫生部第45号令2006年2月1日.
6.祁国明.病原微生物实验室生物安全.北京：人民卫生出版社，2006.第三章 分枝杆菌菌株的保存、运输和管理第一节 菌株保存一、目的
分枝杆菌菌株是微生物学以及生命科学相关研究的基本材料，为了更好地保护和利用生物资源，实验室根据需要可对分枝杆菌菌株进行保存管理。二、原理
菌株保存主要是根据微生物的生理生化特点，人工地制造环境条件，使微生物代谢活动尽量降低，减少变异，即采取低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等方法达到长期保存的目的。三、方法
菌株保存方法，根据需要移种传代间隔的时间，可分为短期（3～24个月）和长期（≥2年）保存方法。（一）短期保存方法
短期保存方法主要针对于实验室日常使用菌株，为了保持分枝杆菌的活性，需要定期转种传代，一般6个月需要转种一次。
1.固体培养基保存法
这是一种最基本的方法，适用范围广，对生长速度快、慢的分枝杆菌都可应用。分离的分枝杆菌转种罗氏培养基（L－J）斜面、在适当孵育温度条件下生长良好后，菌株置于4℃左右保存。该方法对一般慢生型分枝杆菌可保存3～6个月；生长速度快的分枝杆菌能够保存2～3个月。到期后重新转种一次。对于个别菌种需要结合菌种所需的营养条件、生长速度、繁殖能力对移种传代的时间间隔进行适当调整。这种方法的弊端是传代次数多容易发生变异，如导致部分分枝杆菌繁殖能力下降、生物性状发生变化、毒力减小甚至基因失落等；同时传代次数多也容易使污染机会增加。应挑选对数生长期的菌株进行传代保存，保存温度应控制2～4℃之间。
2.悬浮液低温保存法
将分枝杆菌充分悬浮于经高压灭菌的20%甘油／0.25mol（pH 6.5）磷酸盐缓冲液或20%甘油／生理盐水中，使用密封的螺口菌株保存管，－20℃保存。此法可保存1年以上。（二）长期保存方法
适用于仪器设备齐备（如超低温设备、真空干燥设备）、实验防护设施和相关措施较完善、开展科研和检查项目的实验室采用。每支8～10保存管中要求的细菌数量在10 cfu（≥10mg）。以保证被保存菌株经过长期、低温冷冻保存后能够传代复活。
1.悬浮液超低温保存法
悬浮液超低温保存法常用的培养基为7H9培养基、胰蛋白胨培养基、苏通培养基，将10mg分枝杆菌充分悬浮于上述培养基中，使用密封的螺口菌株保存管，－70℃保存。（1）7H9培养基配制方法：
4.7g 7H9粉、200ml丙三醇、700ml蒸馏水，高压灭菌（121℃，15分钟），冷却后加100ml OADC营养添加剂，4℃保存。（2）苏通培养基：
4.0g天门冬素、2.0g柠檬酸、0.5g KHPO、0.5g MgSO·2447HO、0.05g柠檬酸铁铵、200ml丙三醇、800ml蒸馏水，用氨水调2pH至7.2，高压灭菌15分钟，4℃保存。（3）胰蛋白胨培养基：
胰蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，调pH至7.0，121℃高压灭菌15分钟，4℃保存。
2.液氮保存法
将菌悬液加入灭菌后的保护剂（终浓度为10%甘油／生理盐水或5%二甲基亚砜水溶液）中。第二节 痰标本及菌株运输一、目的
为确保痰标本和菌株的运输过程中，在保证安全、符合国家相关生物安全要求的前提下，满足相关临床检测和防治工作的需要。二、原则
严格按照原卫生部颁布的可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定开展菌（毒）种或样本的运输工作。三、具体操作（一）法律依据
法律依据是原卫生部令第45号《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。（二）申请材料
申请运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的单位（以下简称申请单位），在运输前应当向省级卫生行政部门提出申请，并提交以下申请材料（原件一份，复印件三份），其中一部分由接收高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的单位（以下简称接收单位）来准备。
1.申请单位准备材料：（1）可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输申请表。（2）法人资格证明材料（复印件）。（3）容器或包装材料的批准文号、合格证书（复印件）或者高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输容器或包装材料承诺书。（4）其他有关资料
1）申请运输的文字说明材料，包括运输原因、目的、起止时间、方式、数量、频次、承诺等。
2）运输相关证明材料，如中国结核病防治规划实施工作指南、项目协议（含盖章部分）及相关要求。
2.接收单位准备材料（1）法人资格证明材料（复印件）。（2）接收单位同意接收的证明文件。（3）具备从事高致病性病原微生物实验活动资格的实验室备案证明或有关政府主管部门核发的从事高致病性病原微生物实验活动、菌（毒）种或样本保存、生物制品生产等批准文件。（三）申请过程
1.省内运输
申请在省、自治区、直辖市行政区域内运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，由省、自治区、直辖市卫生行政部门审批，审批通过后颁发《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。
2.省间运输
申请跨省、自治区、直辖市运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的，应当将申请材料提交运输出发地省级卫生行政部门进行初审；对符合要求的，省级卫生行政部门出具初审意见，并将初审意见和申报材料上报卫生部审批，审批通过后颁发《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。（四）运输包装
1.包装
运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本的容器或包装材料应当达到国际民航组织《危险物品航空安全运输技术细则》（Doc9284包装说明PI602）规定的A类包装标准，符合防水、防破损、防外泄、耐高温、耐高压的要求，并应当印有原卫生部规定的生物危险标签、标识、运输登记表、警告用语和提示用语。
结核分枝杆菌培养物和痰标本，结核分枝杆菌属于A类传染性物质，运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。痰标本属于A类传染性物质的相关样本，运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。
菌株或活菌培养物运输（A类UN2814）的包装见图3－1和图3－2。痰标本运输（UN3373）的包装见图3－3和图3－4。图3－1 UN2814类冷藏包装图3－2 UN2814类不冷藏包装图3－3 UN3373类冷藏包装图3－4 UN3373类不冷藏包装
包装时要满足三层包装体系，即防水的主容器、防水的次容器、强度满足其容积、质量及使用要求的刚性外包装（图3－5）。图3－5 三层包装体系
2.标记
一个完整的包装件需要有如下标记：（1）UN或ID编号。（2）运输专用名称（感染性物质，可感染人类）。（3）托运人名称和地址。（4）收货人名称和地址。（5）负责人24小时紧急电话。（6）净数量。（7）如使用干冰做制冷剂，应标出干冰、UN1845以及干冰的净重。
标记实例见图3－6和图3－7：图3－6 菌株或活菌培养物（UN2814）标记示例图3－7 痰标本（UN3373）标记示例
3.标签
运输中常用的标签如下：（1）高致病性病原微生物危险标签（图3－8）。（2）A类相关样本及B类的病原和相关样本标签（图3－9）。图3－8 高致病性病原微生物危险标签图3－9 A类相关样本及B类的病原和相关样本标签（3）外包装放置方向标识（图3－10）。图3－10 外包装放置向上标识（五）运输方式
1.陆路运输
运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本，应当有专人护送，护送人员不得少于两人，护送过程中携带《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。申请单位应当对护送人员进行相关的生物安全知识培训，并在护送过程中采取相应的防护措施。
2.航空运输
申请单位应当凭省级以上卫生行政部门或中国疾病预防控制中心核发的《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》到民航等相关部门办理手续。
托运人应当按照《中国民用航空危险品运输管理规定》（CCAR276）和国际民航组织文件《危险物品航空安全运输技术细则》（Doc9284）的要求，正确进行分类、包装、加标记、贴标签并提交正确填写的危险品航空运输文件，交由民用航空主管部门批准的航空承运人和机场实施运输。如需由未经批准的航空承运人和机场实施运输的，应当经民用航空主管部门批准。第三节 菌株保存、运输相关注意事项一、菌株保存
1.在菌（毒）种样品收集、筛选、分析、鉴定、保存、复苏过程中做好个人防护，严格按照生物安全Ⅱ级实验室操作要求进行各项实验的操作。
2.菌株库设有专门的管理人员2名，做到双人双锁管理。
3.菌株要分类归放。
4.保存机构应当建立完善的技术资料档案，详细记录所保存的菌（毒）种和样本的名称、编号、数量、来源、病原微生物类别、主要特性、保存方法等情况。
建立完善的纸质及电子数据库，档案数据库要永久保存。
5.制订实验室安全事故处理应急预案。
6.建立详细的菌（毒）种出入库记录。
7.建立有效的菌（毒）种和样本销毁记录。二、菌株运输
1.运输过程中需要不少于2名接受过专业培训的人员运送菌株，包括省内各单位之间和单位到机场之间。
2.申请单位应当对护送人员进行相关的生物安全知识培训。在护送过程中采取相应的防护措施，并携带必要的应急防护用品，如口罩、帽子、手套、防护服、消毒剂等。
3.运输过程中要携带卫生部或省级卫生行政部门颁发的《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。
4.可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种运输管理培训班一般由中国疾病预防控制中心、航空公司、公安部门组织培训颁发证书。
5.在运输结束后，申请单位应将运输情况向原批准部门书面报告。三、菌株接收
1.实验室应设置单独的标本接收处。工作人员应穿戴符合生物安全防护水平相适应的个人防护用品（包括隔离衣、帽、口罩、手套等）。
2.应由检验人员或经培训合格的专人验收，在接收记录簿、计算机或其他实验室信息系统（LIS）中对收到的所有原始样本进行记录，记录收到的日期和时间以及接收者。
3.应制订有关接收标本的标准。接收标本时，确认标本标记清晰并附有相应的化验单，两者信息必须一致。应认真核对，包括标本的类型、质量、体积、检查项目、标本采集和运送是否合乎要求等，标本送检人员和标本接收人员都要做认真的记录并签字存档。
4.应制订有关拒收样本的标准。如接收了不合格的原始样本，应在其最终的报告中说明样本不合格的原因，并在检验结果解释中予以说明。参考文献
1.中华人民共和国传染病防治法，2004年8月28日修订通过，2004年12月1日起施行.
2.中华人民共和国卫生部.可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定，2005年12 月28日颁布，2006年2月1日起施行.
3.中华人民共和国.病原微生物实验室生物安全管理条例，2004年11月5日国务院第69次常务会议通过，2004年11月12日起施行.
4.中国民航总局.中国民用航空危险品运输管理规定》，2004年9月1日起施行.
5.中华人民共和国卫生部.人间传染的病原微生物菌（毒）种保存机构管理办法，2009年7月16日颁布，2009年10月1日起施行.
6.中华人民共和国卫生部.中国医学微生物菌种保存管理办法，1985年3月23日.
7.祁国明.病原微生物实验室生物安全.北京：人民卫生出版社，2006.第四章 抗酸杆菌显微镜检查标准化操作程序
抗酸杆菌显微镜检查是采用碱性复红或荧光等染料对临床标本或分枝杆菌培养物进行特殊染色后在光学显微镜下观察其细菌染色特点和数量等级的结核病实验室诊断常规方法。第一节 萋－尼氏染色显微镜检查一、检验目的
检测样本中有无抗酸杆菌，为结核病的临床诊断提供参考依据。二、方法原理
依据分枝杆菌细胞膜含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，分枝菌酸具有抗酸性，染料将分枝杆菌染色后，分枝杆菌细胞膜能抵抗乙醇等脱色剂作用，使分枝杆菌能保持染料的颜色。分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、RNA蛋白及其细菌壁的完整性相结合的综合反应，即抗酸性的强弱除与细菌壁的完整性有关以外，还与其细菌成熟和衰老程度有关。
萋－尼氏染色法，是复红染色液在石炭酸的协同作用下，并对涂片加热促进染色剂同被染细胞的结合，将抗酸杆菌染成紫红色，随后使用酸性酒精脱色，抗酸杆菌能保持紫红色，而其他脱落细胞或标本中的非抗酸杆菌被酸性酒精脱去颜色，后经复染剂亚甲蓝复染为蓝色，光学镜下观察，可在蓝色背景下看到紫红色的杆状抗酸菌。
方法简单、快速、易行且成本低，适于基层广泛开展工作。但是敏感度较低，直接涂片抗酸杆菌显微镜检查的敏感度（5000～10 000菌条／毫升样本）明显低于分枝杆菌培养敏感度（100菌条左右／毫升样本），更低于分子生物学诊断技术敏感度（10菌条左右／毫升样本），阳性结果只能确定是抗酸杆菌感染。三、检测样本
检测样本包括痰、胸水、腹水、尿液、脑脊液、胃液、脓液（分泌物、穿刺液等）、病理组织或干酪块、粪便和咽喉棉拭子等临床标本和分枝杆菌培养物。四、仪器设备
生物安全柜、离心机、天平、高压蒸气灭菌器、冰箱、光学显微镜、涡旋振荡器等。五、试剂耗材（一）萋－尼氏染色液配制
1.0.8%碱性复红染液（1）碱性复红乙醇储存液：
8g碱性复红溶于95%酒精溶液100ml中。（2）5%石炭酸水溶液：
5g石炭酸溶于100ml蒸馏水中。（3）碱性复红染色应用液：
10ml碱性复红乙醇储存液与90ml 5%石炭酸水溶液混合。
2.5%盐酸乙醇脱色液
5ml浓盐酸与95ml 95%乙醇混合。
3.0.06%亚甲蓝复染液（1）亚甲蓝储存液：
0.3g亚甲蓝溶于50ml 95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。（2）亚甲蓝复染液：
以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液即得亚甲蓝复染液。（二）耗材
磨砂载玻片、竹签、2B铅笔、镜油、染色架、玻片盒等。六、操作步骤（一）涂片制备
1.直接涂片（1）使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经95%乙醇脱脂，干燥、清洁后备用。（2）用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号。（3）确保玻片的编号与痰盒上的编号相同。（4）在生物安全柜中，小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。（5）仔细观察标本，使用折断的竹签毛茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05ml，于玻片正面轻轻环状均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜（见图4－1）。图4－1 制备好的痰涂片示例（6）痰膜朝上静置在生物安全柜中自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色。（7）涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。
注意：打开痰标本容器时，防止产生气溶胶或使标本外溢；为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。
2.离心沉淀集菌涂片2
留取的痰标本，经高压蒸气（1.0kg／cm，121℃，15～20分钟）液化和灭活处理，取出放冷后，取5～10ml盛于容积为50ml的离心管玻中加灭菌蒸馏水20～30ml，振荡器上振荡5～10分钟，在3000g离心15～30分钟，使结核菌集中于试管底部，取沉淀物涂片。
3.其他类型临床标本（1）脓液：
同痰液涂片。（2）病理组织或干酪块：
先将组织研磨器研磨后再进行涂片。（3）尿液：
送检标本应首先静置2～4小时，取沉淀部分约20～50ml，3000g离心20～30分钟，取沉淀涂片。（4）胸、腹水标本：
参照尿液涂片。（5）脑脊液：
无菌操作收集脑脊液，置冰箱或室温24小时，待薄膜形成后进行涂片；或将脑脊液3000g离心20～30分钟，取沉淀涂片检查。（6）粪便：
标本与生理盐水混合后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经3000g离心20～30分钟；沉淀进行涂片检查。（7）咽喉棉拭子：
棉拭子放入无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，并强烈振荡，取出棉拭子后，液体在于3000g离心20～30分钟，沉淀进行涂片检查。（二）抗酸染色
1.固定
涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上的距离；加热固定（在5秒内将玻片经过火焰加热4次）。
2.初染
滴加石炭酸复红染液盖满痰膜，加热至出现蒸气后，停止加热，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加热时勿使染色液沸腾。高海拔地区应适当增加加热次数和染色时间。
3.水洗
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4.脱色
自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脱色1分钟；如有必要，流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
5.水洗
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
6.复染
滴加亚甲蓝复染液，染色30秒。
7.水洗
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
8.效果
一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色斑块。（三）显微镜检查
1.使用“10×”目镜，双目显微镜读片。
2.取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。
3.首先使用“40×”物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态。
4.移开“40×”物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用“100×”油镜进行细致观察；但应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
5.读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推（图4－2）。通常20mm的痰膜，使用“100×”油镜，每横行约有100个视野。
6.在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其他细菌和细胞呈蓝色。
7.仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不应超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。七、结果判读（一）形态学特征
结核分枝杆菌基本形态为细长、直或稍弯、两端钝圆、有微荚膜、无芽胞、无动力的杆菌，常呈分枝状生长。菌体宽度在0.2～0.6μm之间，菌体长1～10μm（通常3～5μm）。菌体的一端或两端有较深的异染颗粒，富含多磷酸盐，可能是能量储存和氧化还原反应的场所，有时可呈串珠状。在结核病人痰标本中结核分枝杆菌可单个散在、2个以上呈“人”、“Y”等排列，缠绕呈索状或丛状时为有毒株的典型形态学特征。图4－2 镜检读片移动方式
结核分枝杆菌在不利条件下导致细胞壁缺陷或部分缺陷（L型细菌）呈现出颗粒型、滤过型和球菌型等不典型形态。在结核分枝杆菌发育的特定阶段，可表现为非抗酸性、非细菌细胞性、革兰染色阳性的颗粒型体。
非结核分枝杆菌形态和抗酸性通常都不典型。（二）镜检结果分级报告标准
1.萋－尼氏染色抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
2.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性抗酸杆菌菌数：1～8条／300视野。
3.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条／100视野，连续观察300个视野。
4.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／10视野，连续观察100个视野。
5.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条／1视野。
6.萋－尼氏染色抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条／1视野。
报告“1＋”时至少观察300个视野，报告“2＋”至少观察100个视野，“3＋”、“4＋”时至少观察50个视野。
不典型抗酸菌（如：颗粒体、丝状体、巨球体等），按实际观察情况描述报告结果。例如：萋－尼氏染色阳性颗粒体（2＋）。表4－1 痰涂片检查结果登记本示例续表填写说明：
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]