作者：郭俊明,汤华
出版社：人民卫生出版社
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非编码RNA与肿瘤试读：
版权页图书在版编目（CIP）数据
非编码RNA与肿瘤/郭俊明，汤华主编.—北京：人民卫生出版社，2014
ISBN 978－7－117－18487－8
Ⅰ.①非… Ⅱ.①郭…②汤… Ⅲ.①核糖核酸－关系－肿瘤－研究 Ⅳ.①Q552②R73
中国版本图书馆CIP数据核字（2014）第036368号人卫社官网 www.pmph.com 出版物查询，在线购书人卫医学网 www.ipmph.com 医学考试辅导，医学数据库服务，医学教育资源，大众健康资讯
版权所有，侵权必究！非编码RNA与肿瘤
主 编：郭俊明 汤 华出版发行：人民卫生出版社有限公司
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随着人类基因组计划的不断拓展、后基因组时代的来临，人们对人类基因组结构和功能的认识不断深化。近些年来，新一代高通量基因测序技术和大规模转录组学研究的成果层出不穷，为我们揭示基因的奥秘提供了新思路。
目前，以“DNA－RNA－蛋白质”为中心的遗传学法则和传统基因表达调控模式等经典理论受到前所未有的挑战。人们发现，在人类基因组中约93%的序列可被转录，其中具有蛋白质编码功能的转录物不超过2%，而占转录组90%以上的是无蛋白质编码功能的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。
非编码RNA种类繁多、数量庞大、功能丰厚。非编码RNA已不再是早先人们认为的基因转录“副产品”或“暗物质”，它们广泛参与生命现象的各个环节，包括生长、分化、发育、免疫和凋亡等。“非编码”RNA并不是“非功能”RNA，“小RNA”同样有大作为。
肿瘤是严重危害人类健康和生命的常见疾病，是多因素引起、多基因参与、多阶段形成的异质性疾病。最近，研究者们发现，非编码RNA在肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用。非编码RNA是基因表达的重要调控分子，研究其生物合成过程、生物学功能及其与肿瘤的关系有利于我们进一步理解恶性肿瘤的异质性，并为建立有效诊治新技术提供新线索。
参加本书编写的专家学者为宁波、天津等地从事非编码RNA与肿瘤相关的科研、临床专家学者，各章编写分工为：第一章和第五章第二节（郭俊明）；第二章（肖丙秀）；第三章（汤华）；第四章（夏天）；第五章第一、三节和第九章第一节（季林丹）；第五章第四、五节和第九章第三节（李庆宁）；第六章（龚朝辉）；第七章（李怡璇）；第八章（王芳）；第九章第二节（杜艳涛）。“非编码RNA与肿瘤”是一个全新的领域，其中包含着众多未知事物，若想在一本书中对它作出全面概括是完全不可能的；况且由于编者水平有限，本书难免有错误或不足之处，恳请同行和读者批评指正。
本书可作为内科医师、外科医师、肿瘤科医师及其他相关科室医师、科研人员、医学院校师生的参考书；也可作为相关学科研究生、继续教育的教材。
本书是在人民卫生出版社的关心和支持下完成的，并受到国家、省市相关科研基金的资助，在此一并致谢。郭俊明 汤华2014年3月Table of Contents第一篇 总 论 第一章 非编码ＲＮＡ概述第二章 非编码ＲＮＡ研究的基本技术第三章 非编码ＲＮＡ与肿瘤的发生和诊治第四章 非编码ＲＮＡ数据库简介与应用第二篇 各 论 第五章 非编码ＲＮＡ与消化系统肿瘤第六章 非编码ＲＮＡ与呼吸系统肿瘤第七章 非编码ＲＮＡ与泌尿生殖系统肿瘤第八章 非编码ＲＮＡ与淋巴造血系统肿瘤第九章 非编码ＲＮＡ与其他常见肿瘤中英文索引第一篇 总 论第一章 非编码ＲＮＡ概述第一节 非编码RNA的基本概念
人类基因组计划的完成，特别是近年来大规模转录组研究的日益深入，使传统的遗传学中心法则和经典的基因表达调控模式受到了严重的挑战。尽管编码蛋白质的基因仅占人类基因组中不到2%的序列，但是人们发现基因组中绝大多数序列是被转录的。在人类基因组中不到2%的序列编码了约2万个蛋白质，其他98%的人类基因组序列不编码蛋白质。然而，基因组叠瓦式芯片（tiling array）等技术的研究结果说明，转录不仅仅局限于蛋白质编码基因，超过90%的人类基因组序列可以转录。
随着RNA研究的逐步深入，人们对其功能的了解逐渐加深。为便于理解RNA的功能，可以把它们分成不同的类别（图1－1）。
根据基因表达的最终产物是否为蛋白质，可以把RNA分为两大类：编码RNA（coding RNA）和非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。顾名思义，编码RNA是指能指导蛋白质合成的RNA，即信使RNA（messenger RNA，mRNA）；而ncRNA则是指不编码蛋白质的RNA。
与mRNA相似，ncRNA也是单链的RNA。长期以来，这些ncRNA以及它们所对应的DNA被认为是垃圾或“暗物质”。随着人类基因组计划的完成，科学家们惊奇地发现人类基因组中能编码蛋白质的DNA只占整个基因组序列的极少数，而ncRNA及其所对应的DNA的数量远远多于编码蛋白质的mRNA及其所对应的DNA的数量。
根据生物进化遵循的“用进废退”原则，ncRNA如果是垃圾，它们应该会随着生物进化而逐渐被淘汰，然而人们却发现mRNA的比例随着物种进化呈明显下降的趋势；相反的，ncRNA的比例则随着物种进化呈上升的趋势。这种现象告诉我们，生物进化得越高等，其基因组中ncRNA所对应的DNA的比例越高。在进化上处于金字塔顶端的人类，基因组中的ncRNA的比例竟达到98%。
研究发现，ncRNA不仅不是垃圾，而且广泛参与生命现象的各个环节，包括生长、分化、发育、免疫等，甚至在肿瘤的形成中也具有重要的调控作用。图1－1 RNA的分类第二节 非编码RNA的分类一、根据功能不同区分非编码RNA
ncRNA种类繁多，分类方法有多种。可根据其是否具有功能，分成无功能ncRNA和功能性ncRNA。功能性ncRNA又可以根据功能不同分为看家ncRNA（house－keeping noncoding RNA）和调节ncRNA（regulatory noncoding RNA）两大类。
1.看家ncRNA
这是组成性表达的RNA，它们具有与细胞存活至关重要的一系列功能。它们通常稳定表达，其表达水平受体内外环境变化的影响不明显。看家ncRNA包括：转运RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和核小RNA （small nuclear RNA，snRNA）等。这类ncRNA大多数与蛋白质的合成过程有关，如：参与蛋白质生物合成的ncRNA有tRNA和rRNA；与转录后加工有关的RNA有snRNA等。tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，后者是蛋白质合成的场所。snRNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spliceosome）的主要成分。现在发现有5种snRNA，在哺乳动物中其长度约为100～215个核苷酸（nucleotide，nt）。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。
另外，看家ncRNA还有端粒酶RNA（telomerase RNA），它与染色体末端的复制有关，参与维持真核生物染色体的完整性。
2.调节ncRNA
调节ncRNA在细胞分化和器官发育的特定阶段或应对外界刺激时表达。它们在转录和（或）翻译水平等层次影响其他基因的表达。这是目前研究最为热点的ncRNA，它们与疾病的关系也最为密切，将在下面章节中详细描述。
3.兼有看家功能和调节功能的ncRNA
既有看家功能又有调控功能的ncRNA主要有核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。snoRNA是一类种类非常丰富的ncRNA，主要参与rRNA及其他RNA的修饰、加工及成熟过程。所以说，snoRNA就像理发师和美容师一样，参与RNA剪接和RNA修饰。二、根据长短不同区分非编码RNA
根据链的长短不同，调节ncRNA分为短链ncRNA、中链ncRNA和长链ncRNA。这些ncRNA又可进一步细分成若干个亚类（表1－1）。表1－1 非编码RNA的分类注：在分布档中“－”和“＋”分别表示转录起始点（transcription start site，TSS）上游和下游碱基对的位置。lincRNA：长链基因间非编码RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）；lncRNA：长链非编码RNA（long noncoding RNA）；miRNA：微RNA（microRNA）；piRNA：Piwi相互作用RNA（Piwi－interacting RNA）；PASR：启动子相关小RNA（promoter－associated small RNA）；PROMPT：启动子上游转录本（promoter upstream transcript）；snoRNA：核仁小RNA（small nucleolar RNA）；tiRNA：转录起始RNA（transcription initiation RNA）；TSSa－RNA：转录起始点相关RNA （TSS－associated RNA）；T－UCR：转录超保守区（transcribed ultraconserved region）（一）短链ncRNA
短链ncRNA是指长度在50nt之内的ncRNA，包括微RNA（microRNA，miRNA）、Piwi相互作用RNA（Piwi－interacting RNA，piRNA）和转录起始RNA（transcription initiation RNA，tiRNA）等。它们具有重要的基因表达调控功能，可诱导染色质结构的变化、介导mRNA的降解等，或者具有降解外源核酸序列的作用以保护本身的基因组。
1.miRNA
miRNA是一类19～24nt左右的ncRNA，是目前研究得最清楚的一类ncRNA。miRNA首先由Lee等于1993年在秀丽线虫中发现。Reinhart等于2000年发现miRNA具有控制线虫发育的重要功能。随后，miRNA成为生命科学和医学研究的热点之一。miRNA已经成为人们阐明一些重要疾病的发生机制和进行疾病诊断与治疗的新切入点。
据估计，miRNA调节超过60%的蛋白质编码基因的表达。它们的功能很广泛，包括调节细胞增殖、分化、凋亡和发育等过程。
目前发现，成熟miRNA一般具有如下特点：（1）在进化过程中呈现高度保守性：
约有12%的miRNA在脊椎动物和非脊椎动物中呈现高度的保守性。这些保守片段只有1～2个碱基的差别，而在脊椎动物已经发现的miRNA中近一半具有同源性。（2）miRNA基因呈簇集性出现：
许多miRNA不呈分散分布，由单一前体miRNA加工而来的成熟miRNA具有基因簇集现象。Calin等对186种miRNA的基因研究发现，52.5%（98／186）的基因常常位于染色体的脆性位点。（3）miRNA在生物体呈现时间特异性和空间特异性表达：
某些miRNA可以在某一生物体的某种细胞中表达但在同一生物体中的其他细胞中不表达，甚至同种组织在不同发育时期检测的结果也不同。
2.piRNA
piRNA的长度大约是26～31nt，比miRNA稍长。它们最初在哺乳动物的睾丸中被发现，并且可以和Piwi蛋白结合形成piRNA复合物，然后发挥作用。目前已发现的piRNA主要存在于基因间隔区，而很少存在于基因区和重复序列区。
piRNA与miRNA的主要区别在于：（1）形成过程中不依赖Dicer酶。（2）通过结合Ago蛋白的Piwi亚族发挥作用：这一特点也是它被命名的依据。其他物种中的Piwi同源蛋白则根据其物种名称的首字母来依次命名，如人类的Piwi同源蛋白为Hiwi。在果蝇、鼠类和斑马鱼等的研究中显示，piRNA在生殖干细胞分化、胚胎发育、维持DNA的完整性和表观遗传学调控等方面具有十分重要的生物学作用。（二）中链ncRNA
中链ncRNA的长度一般在50～200nt之间，主要包括snoRNA、启动子相关小RNA （promoter－associated small RNA，PASR）、转录起始点相关RNA（transcription start siteassociated RNA，TSSa－RNA）和启动子上游转录本（promoter upstream transcript，PROMPT）。在这些ncRNA中研究得最多的是snoRNA。
snoRNA是真核细胞核仁中的小分子非编码RNA，链长在60～300nt之间。它们的主要功能是参与细胞质中rRNA和其他RNA转录后的加工过程，如假尿苷化和2′－甲基化等。
根据结构元件的不同，人们常把snoRNA分为3大类：C／D box snoRNA、H／ACA box snoRNA和MRP RNA。MRP RNA是极为特殊的snoRNA，在数量和功能上都迥异于其他两类snoRNA，它们参与5.8SrRNA的加工和线粒体DNA的复制。细胞中主要的snoRNA是C／D box snoRNA和H／ACA box snoRNA。
C／D box snoRNA包含有两个短的特征性序列元件，即位于5′末端的C box（RUGAUGA，R代表嘌呤核苷酸）和3′末端的D box（CUGA）。大部分C／D box snoRNA分子的中部还具有类似于C box和D box的结构，分别被称为C′box和D′box（图1－2A）。C／D box snoRNA通过碱基互补作用行使功能，即：参与rRNA特定位点的2′－O－甲基化修饰。图1－2 两类主要snoRNA的结构
H／ACA box snoRNA具有保守的“发夹－铰链－发夹－尾（hairpin－hinge－hairpin－tail）”的二级结构。H box（ANANNA，N代表任一核苷酸）位于单链形式的铰链区，而ACA box则一般位于3′末端上游3个核苷酸处（图1－2B）。H box和ACA box不仅是snoRNA正确行使功能的必需结构，而且与snoRNA的稳定性密切相关。H／ACA box snoRNA的主要功能是参与rRNA的假尿嘧啶化修饰。
经snoRNA加工成熟的rRNA先在核仁中与核糖体蛋白结合，再经过复杂的进一步成熟过程和转运过程出核，最终在细胞质中形成功能成熟的核糖体。核糖体是蛋白质合成的场所，几乎控制着细胞内所有蛋白质的合成。由此不难看出，snoRNA对于细胞生长乃至生命活动的重要性。
上述两类主要的snoRNA均需与特异性蛋白质结合形成核仁小核糖核蛋白复合体（small nucleolar ribonucleoprotein complexe，snoRNP）后才能发挥作用。研究发现，不仅C／D box和H／ACA box snoRNA在进化过程中是高度保守的，而且snoRNP中的核心蛋白质也是高度保守的。这说明，snoRNA和snoRNP在细胞内行使的功能是古老而基础性的。（三）长链ncRNA
长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）一般是指大于200nt的ncRNA。这一类ncRNA在人类基因组中分布非常广泛，也是最近几年才发现并被重视的ncRNA，其中最先发现的lncRNA为长链基因间非编码RNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）。
与其他ncRNA相比较，lncRNA具有“三多”的特点，即：类型多、作用模式多和数量多。lncRNA可分为正义（sense）、反义（antisense）、双向（bidirectional）、基因内（intronic）及基因间（intergenic）等5种类型（图1－3），lncRNA所在的位置与其功能有一定的相关性。图1－3 lncRNA的主要类型编码RNA和非编码RNA分别用□和○表示
正因为lncRNA的类型多样，造就了它们对基因表达调控模式的丰富多彩：（1）通过在蛋白质编码基因的上游启动子区转录而干扰下游基因的表达。（2）通过抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性或者介导染色质重构和组蛋白修饰而影响下游基因的表达。（3）通过与蛋白质编码基因的转录本形成互补双链，然后干扰mRNA的剪切，从而产生不同的剪切体。（4）通过与蛋白质编码基因的转录本形成互补双链，然后在Dicer酶的作用下产生内源性的siRNA，进而抑制基因的表达。（5）通过与特定蛋白质结合从而调节其活性。（6）作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体。（7）通过结合到特定蛋白上改变其在胞质中的定位。（8）作为短链非编码RNA（如miRNA或piRNA）的前体进行转录。
总之，lncRNA可以通过改变染色质的结构来调节基因的表达，也可以通过顺式或反式方法来沉默或激活一个基因或一个基因家族，甚至整条染色体（图1－4）。图1－4 lncRNA的作用机制第三节 非编码RNA的生物合成一、短链ncRNA的生物合成
1.miRNA的生物合成
miRNA基因通常是由RNA聚合酶Ⅱ转录的，初始转录产物为具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的初始miRNA（primary miRNA，pri－miRNA）。生成的pri－miRNA有数千nt长，然后在核酸内切酶和双链RNA结合蛋白等的相继作用下形成约70nt、具有发夹结构的前体miRNA（precursor miRNA，pre－miRNA）。pre－miRNA在转运蛋白Exportin－5的介导下从细胞核进入到细胞质中，然后被Dicer核酸酶Ⅲ等剪切形成较短的双链miRNA中间体（引导链和随从链），其中引导链（成熟miRNA）进入RNA介导的沉默复合体（RNA－induced silencing complex，RISC）；最后，miRNA引导RISC以碱基互补配对的方式结合目标mRNA的3′－非翻译区（3′－untranslated region，3′UTR），当该复合物中的成熟miRNA与靶mRNA完全互补时，降解靶mRNA；若不能完全配对，则抑制靶mRNA编码蛋白质的合成（图1－5）。
2.piRNA的生物合成
目前，对piRNA产生机制的认识主要来自于对它们在基因组上的定位和与其结合的Ago蛋白的研究。在果蝇的卵巢中，大量的piRNA主要由富含逆转座子序列的染色体末端着丝粒和端粒位点编码产生。绝大多数的piRNA来自于逆转座子的反义链，这一类反义piRNA优先结合Ago蛋白家族中的Piwi和Aubergine（Aub）；相反，正义piRNA则优先与Argonaute3（Ago3）结合。Piwi、Aub和Ago3与piRNA组成的复合体可以在引导链的第10位和第11位之间对互补配对的靶RNA进行剪切。值得注意的是，果蝇piRNA的每一条链都与其互补链具有10nt长度的互补序列。反义piRNA与Piwi和 Aub相结合并且具有强烈的5′尿嘧啶偏向性；而正义piRNA则与Ago3结合并且在第10个碱基位点具有腺嘌呤残留。基于这些发现，有学者构建了一个乒乓球样循环扩增模型，解释了piRNA生物发生的机制。在这个模型中，与正义piRNA结合的Ago3在A和U结合配对的位点对反义链的piRNA进行催化切割，从而产生反义piRNA的5′端。此产物又与Aub或Piwi结合共同作用于3′端的互补区进而产生26～31nt的成熟反义piRNA。成熟的反义piRNA－Ago蛋白复合体又结合并且切割与其互补的正义链RNA，进而沉默基因的表达。在此过程中也相应地生成了与Ago3相结合的正义piRNA前体的5′端。在3′端重叠区域形成的同时，成熟的正义piRNA也随之产生，一个循环到此结束（图1－6）。图1－5 miRNA合成和作用机制示意图
上述过程不仅连续制造新的piRNA，而且不断破坏靶RNA。与转座子序列相对应的正义piRNA和反义piRNA含量也相应增加，转座子的表达活性则被抑制。并推测piRNA单链自身互补的碱基之间可以配对以形成局部双链的高级结构来发挥作用（图1－6B）。尽管这个模型是基于对果蝇的研究提出的，但相似的机制在鼠类等哺乳动物之中也可能存在。在这个模型中，虽然有一些关键蛋白（包括在多个环节中起调节作用的蛋白）还没有被鉴定出来，但是最近的一些研究结果或许有助于填补这些空白。例如，果蝇的zucchini和squash基因均编码piRNA形成过程中所必需的核酸酶，它们的突变阻断了piRNA的生成。因此，Zucchini和Squash这两种蛋白可能有助于产生piRNA 3′端的延长部分和生成成熟的piRNA。图1－6 piRNA生物合成的乒乓模型及其预测的二级结构A.乒乓模型；B.预测的二级结构二、中链ncRNA的生物合成
由于中链ncRNA中研究得最为清楚的是snoRNA，所以此处只介绍这类ncRNA的生物合成。
编码snoRNA的基因可以是独立的基因，也可以存在于蛋白质编码基因的内含子中。独立编码型snoRNA的转录往往由RNA聚合酶Ⅱ催化；而大多数内含子编码型snoRNA的产生常伴随着mRNA前体的剪切加工形成，少部分通过核酸内切酶直接从mRNA前体中水解而来（图1－7）。图1－7 哺乳动物snoRNA的合成
上述三类ncRNA（miRNA、piRNA和snoRNA）的生物合成具有一定的相似性，现总结成图1－8。图1－8 miRNA、piRNA和snoRNA生物合成过程的比较三、长链ncRNA的生物合成
目前对于lncRNA来源尚不十分清楚，Ponting等认为其可能来源于以下途径：①在早期进化时由蛋白质编码基因的开放阅读框发生突变而成；②由染色质重排，导致两个原本距离较远的非转录片段串联到一起而成；③非编码基因通过反转录转座作用形成；④ncRNA内部某段序列的重复复制，产生了具有相邻重复序列的lncRNA；⑤转录元件插入形成新的lncRNA。
大多数lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ催化转录生成，少部分由RNA聚合酶Ⅲ催化转录生成。根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，它们的合成可以分为5种方式（图1－9）：合成正义链、合成反义链、双向合成、合成内含子、基因间合成。有些合成好的lncRNA也有可能经过加工过程形成成熟lncRNA，还有一些可能形成2种以上具有功能的RNA，例如：肺腺癌转移相关转录本1（metastasis－associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）合成的初始产物会经由RNA酶P和RNA酶Z处理后形成2种产物：成熟MALAT1和MALAT1相关小胞浆RNA（MALAT1－associated small cytoplasmic RNA，mascRNA）。前者会移到核斑（nuclear speckle），在癌细胞中发挥促进转移的作用；而后者则会出核至胞浆中，其结构类似于tRNA但不参与蛋白质合成，而可能具有阻止蛋白质合成的功能。图1－9 lncRNA的生物合成
据统计，哺乳动物蛋白编码基因占总RNA的1%，lncRNA占总RNA的比例可达4%～9%，这些lnc RNA是基因功能研究的又一座宝库。目前发现的许多lncRNA都具有保守的二级结构、一定的剪切形式以及亚细胞定位。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。第四节 非编码RNA的主要功能
关于ncRNA的功能是目前ncRNA研究领域中最难的，也是最不清晰的。根据现有资料，ncRNA的功能是广泛的，可以在DNA水平、mRNA水平和蛋白质水平上发挥作用（图1－10）。更好地了解ncRNA的功能将有助于我们理解细胞的功能及肿瘤发生、发展时基因表达的变化。图1－10 ncRNA的部分功能传统遗传学中心法则中遗传信息的传递方向基本上是从DNA到RNA再到蛋白质（粗黑线），而只有蛋白质可以控制基因的表达（细黑线）。这种模型已被ncRNA的发现所完善，ncRNA可以从多种层次调控基因的表达（虚线），组成了复杂而整合的基因表达调控网络。SRP，信号识别颗粒（signal recognition particle）；TF，转录因子（transcription factor）一、短链ncRNA的生物学功能
1.miRNA的生物学功能
miRNA的功能是通过与靶mRNA结合实现的，主要起负性调控基因表达的功能。当miRNA与靶mRNA不完全互补时可在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3′UTR。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解（在植物中比较常见）。通过这种机制作用的miRNA的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每种miRNA可以有多个靶基因，而几种miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一种miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几种miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。
miRNA调节了细胞生长、组织分化，因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNA在细胞生长和凋亡、血细胞分化、同源异形盒基因调节、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生和胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如：miR－273参与线虫的神经系统发育过程；miR－430参与斑马鱼的大脑发育；miR－181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞；miR－375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR－143在脂肪细胞分化起作用；miR－196参与了哺乳动物四肢形成；miR－1与心脏发育有关；等等。另有，研究人员发现许多神经系统的miRNA在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。对于新的miRNA基因的分析，可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。
2.piRNA的生物学功能
piRNA的生物学作用方式不同于人们较为熟知的其他两类非编码小RNA（siRNA和miRNA）。后两者主要通过与Ago亚家族蛋白相互作用，而piRNA则是通过结合Piwi蛋白形成piRNA复合物（piRNA－Piwi－class－argonaute complexe，piRC）来发挥基因沉默的作用。Ago3蛋白活性的升高可以增加piRNA的含量，使它们产生了反义链偏向性，而piRNA含量的增加可以沉默逆转座子。在piRC介导的基因沉默途径中有多种尚未明确的蛋白质因子参与。因此，对于与piRNA相偶联的蛋白质功能的研究可以为揭示piRNA的生物功能提供可靠的证据。例如，果蝇同源蛋白甲基转移酶5（Drosophila homologue of protein methyltransferase 5，dPRMT5）已经被证明是修饰Aub甲基化的酶，其活性的缺失可以导致果蝇卵巢中piRNA、Ago3和Aub蛋白水平的下降，进而导致卵子发生的异常。这显示了Piwi蛋白的甲基化修饰在piRNA生物功能发挥中的重要性。根据最新的研究结果，推测piRNA可能具有下列生物学功能。（1）维持干细胞和生殖系的功能：
通过对影响果蝇卵子发生和胚胎轴线发育的基因突变研究，Chen等首次鉴定出一些在piRNA作用途径中的相关基因。果蝇卵子的发生是从生殖干细胞的分化开始，最后分裂为1个卵母细胞和15个滋养细胞。在卵子发生过程中卵母细胞大部分时间处于转录沉默状态，滋养细胞为卵母细胞提供了所需的大部分RNA和蛋白质。在果蝇中，胚胎轴线特异性的发育依赖于一类与形态学发生相关的piRNA的不对称分布。Cutoff和aubergine（aub）基因的突变不仅在果蝇轴线特异性发育中影响了这类piRNA在细胞中的分布，还破坏了生殖干细胞的稳定性和卵母细胞的产生。
Piwi基因编码Ago蛋白家族中的Piwi亚族，Piwi基因的突变导致了卵子发生中生殖干细胞的缺失。克隆研究显示，生殖干细胞的稳定和分化需要体细胞中Piwi基因的有效表达以形成干细胞巢。相比之下，在Piwi基因缺失的种系中，干细胞的分化率降低了，但是并没有导致干细胞的缺失和卵子发生的阻滞。其他在piRNA作用途径所需蛋白的基因突变，包括zucchini和squash的突变也导致了生殖干细胞的缺失。现在仍然不清楚这些基因究竟仅仅是在体细胞中必需还是生殖细胞或者两者中均必需。此外，Piwi蛋白和piRNA在生殖干细胞分化和维持方面中的分子功能也未被完全阐明。
小鼠基因组编码三种果蝇Piwi蛋白的同源蛋白——Miwi、Miwi2和Mili。这3种蛋白是雄性小鼠保持生育能力所必需的。Miwi和Mili均可与piRNA相结合，而敲除Miwi和Mili基因将阻碍piRNA的产生，且它们中的任何一个基因发生突变均可以造成雄性小鼠的不育。对小鼠中Piwi蛋白（Miwi、Miwi2和Mili）复合体的纯化和分析发现，Piwi蛋白在它们N末端保守位置的精氨酸是被甲基化的。经证实，在这些蛋白家族中均存在一种精氨酸甲基转移酶。具有Tudor结构域的蛋白家族可以特异地结合甲基化的组蛋白。由精氨酸甲基转移酶催化修饰的Piwi蛋白对引导含有Tudor蛋白家族成员复合物的形成是必需的。具有Tudor结构域的蛋白家族可以识别这些蛋白质，并且特异性地驱动Piwi蛋白在细胞质中的定位和特异位点的聚集。在精子发生的过程中，Tudor家族成员呈现一种动态的表达，并且这种表达方式与在细胞质中生殖质区域的Piwi家族蛋白的表达方式具有一致性。
在Miwi、Miwi2和Mili的突变实验中显示，小鼠的精子发生在其出生后2周是正常的，大体上与减数分裂的第一阶段相协调，然而，在减数分裂以后精细胞却不能形成。Mili和Miwi2的突变在粗线期阻滞了生殖细胞的进一步发育而Miwi突变的精母细胞可以发育成为圆形精细胞，但却不能形成成熟的精子细胞。又有研究发现，在精子发生过程中piRNA特异性地定位在小鼠精母细胞中的联会复合体上并且和转座子的表达密切相关。（2）调控胚胎的发育和保持种系DNA的完整性：
大多数piRNA作用途径的异常都可以引起果蝇轴线发育特异性的缺陷。现已证实，这些缺陷是由DNA损伤信号所产生的。mnk基因编码细胞周期监测点激酶2（checkpoint kinase－2，Chk－2），减数分裂过程中未被修复的DNA活化了Chk2，然后由Chk2诱发了可以观察到的轴线发育缺陷。piRNA作用途径的异常引起的后果也像DNA修复机制相关基因发生的突变一样，是通过激活Chk2作用通路而引起果蝇轴线发育的缺陷。在果蝇卵子发生中，piRNA作用途径的异常可以导致由动力蛋白介导的微管动力复合体聚集。在这一过程中依赖于Chk－2的激活。
在果蝇中，所有piRNA作用途径的异常都明显地导致了逆转座子的过量表达。逆转座子的活化可以引发DNA的损伤，而当piRNA作用途径发生异常后，转座子的高插入率就可以压制DNA的修复机制，进而激活Chk2。目前仍然未知监测点的激活如何导致细胞骨架网络的改变。有一种可能是，监测点的激活直接活化了RNA的转运机制。Navarro等发现，核蛋白聚集体形成是DNA损伤的特异性细胞反应，piRNA生物发生的缺陷可以导致逆转座子RNA水平的上调。在piRNA缺失时，马达动力蛋白机制可以将逆转座子RNA转运到逆转座子降解位点并且在此处发生聚集。此外，piRNA在DNA的修复过程和维持染色质结构对抗DNA损伤方面或许还应该具有更直接的作用。果蝇的端粒是由逆转座子重复序列构成的，piRNA作用途径的异常增加了这种重复性。这预示，piRNA作用途径中相关基因的突变可以导致端粒保护机制的缺失，进而在DNA断裂时发生染色体识别机制的终止，这将不利于维持DNA的完整性。（3）诱导蛋白质翻译过程的沉默：
奥斯卡（Oskar）蛋白在细胞质极质的组装和胚胎模式发育过程中是必不可少的。piRNA作用途径的异常可以影响Osk mRNA和Oskar蛋白在细胞中的定位，并导致了Oskar蛋白在卵子发生过程中的提前表达。HeT－A是果蝇中一个非长末端重复序列逆转座子家族，与转座作用密切相关。在造成piRNA缺失的spindle－E（spn－E）和aubergine（aub）的突变研究中，piRNA作用途径中的蛋白不再与mRNA降解蛋白相关联；与之相伴随的是，在卵巢中spn－E和aub的突变引起了逆转座子全长转录产物与HeT－A mRNA的积聚，影响到转座作用。这些观察说明，piRNA介导的作用是转录后水平的逆转座子沉默。
在果蝇中，piRNA作用途径的异常降低了雄性果蝇的生育能力，这与星状蛋白（stellate protein）的过度表达相关。Stellate是由X染色体上的重复基因编码产生并且受到Y染色体上双向重复序列Suppressor of Stellate［Su（Ste）］基因座的抑制。Su（Ste）基因座编码25－27nt的piRNA，它的突变可以导致星状蛋白成为结晶状，而影响其正常功能的发挥。Kotelnikov等研究发现，敲除Su（Ste）所致的piRNA缺失可以引起星状蛋白水平的明显升高，其升高幅度远远超过星状蛋白mRNA的水平。Su（Ste）重复序列的缺失、piRNA的产生和aub的突变并不导致初级星状蛋白转录物的积累，这说明星状蛋白mRNA主要是通过转录后的降解途径而被沉默的。在对半乳糖（lacZ）标记的星状蛋白基因的研究中发现，敲除Su（Ste）重复序列并没有对Ste－lacZ mRNA的水平产生明显的影响，却大大增加了β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）的活性。Kotelnikov等推测，Ste－lacZ mRNA的含量与一种未知的蛋白相关。已知这种蛋白与星状蛋白mRNA序列特异性的模体相互作用并且抑制了siRNA介导的降解。这暗示，piRNA在基因沉默方面的功能类似于siRNA，与抑制翻译过程相比，更容易使转录物在翻译过程中降解。piRNA介导的星状蛋白基因转录后的沉默机制在细胞核和细胞质中均存在。Su（Ste）piRNA或许优先对细胞质中的转录模板进行引导切割，因为在此处更加容易发生翻译过程。由此可见，piRNA的这种生物特性类似于先前发现的siRNA。
现有的研究说明，piRNA调控体系在基因表达调控中的主要作用是在于消除mRNA的翻译模板功能，遏制反转录酶和转座酶等的活性。此外，除了基因沉默的负调控效应外，部分piRNA可能还有正调控效应，如增加mRNA的稳定性和翻译功能。在小鼠中发现的一类与多核糖体相关的piRNA就有正调控的作用。（4）piRNA参与表观遗传学调控：
Piwi和Aub均参与异染色质的形成，是表观遗传学中的调控因子。Piwi可以防止逆转座子转位，Miwi可增加靶mRNA的稳定性，对翻译具有促进作用。piRC具有序列识别机制，可以产生一系列后生效应，比如引导异染色体蛋白1a （heterochromatin protein1a，HP1a）在基因组中特异性的定位从而进行表观遗传学的调控。Piwi家族在小鼠中的两个成员Mili和Mili2在胚胎生殖细胞特异性地催化转座子DNA的甲基化，从而引起它们在转录水平的抑制。在雄性胎鼠的精原细胞中，存在一种由DNA甲基化和转座因子靶向piRNA构成的精密而复杂的抑制机制，这一机制也被证明参与了转座因子的沉默过程。
遗传学分析显示，生殖细胞和体细胞中与转座子靶向介导的piRNA簇在果蝇科中是保守的。这说明piRNA簇的结构与转座子是协同进化的。在哺乳动物中发现，piRNA基因簇的展开率高于已知的任何一个基因家族；与其他大的基因家族相比，piRNA基因簇没有单个基因簇的缺失。这说明，piRNA基因簇的展开是在进化中主动选择的结果。（5）piRNA在性别决定中的作用：
斑马鱼的基因组编码Ziwi和Zili两种Piwi蛋白的同源蛋白。Ziwi蛋白是小鼠Miwi蛋白同源基因编码的产物，Zili蛋白则与小鼠的Mili蛋白更加近似。只有Ziwi蛋白可以在雄性和雌性的种系中特异性地表达。Ziwi蛋白类似于果蝇中的Ago3和Aub蛋白，它首先在细胞质中出现，然后定位于细胞核周围的生殖质。ziwi基因的突变也可以导致生殖细胞凋亡的缺失。降低ziwi基因的表达水平并不影响雄性生殖细胞存活到成熟阶段，但是却导致成熟生殖细胞凋亡水平的显著增加和多种层次上的不育症。从斑马鱼的卵巢中提取出的piRNA与其他器官中提取的piRNA具有相同的分子功能，并且很多都是源自基因组的重复序列。ziwi的突变也可以影响斑马鱼的性别决定，所有存活的突变动物都是雄性。其他可以降低生殖细胞分裂能力的基因突变也可以影响性别决定。这说明，与生殖细胞的缺失相比，性别决定的表型是次要的。然而，也不能排除piRNA在性别决定方面具有更加直接的作用。二、lncRNA的主要功能
现已发现，lncRNA具有广泛的生物学功能，其功能大致可以概括为：作为信号分子、分子诱饵作用、引导功能和参与组成染色质支架等4个方面（图1－11）。
1.信号分子作用
某些lncRNA的生成具有组织和时间特异性，它们的表达是细胞针对特定刺激（如细胞应激和温度等）起反应的产物。因此，这些lncRNA作为信号分子引起细胞功能的变化，如XIST、AIR和Kcnq1等可起这种作用。图1－11 lncRNA的功能
2.分子诱饵作用
这是一种分子诱饵（molecular decoy）类型的lncRNA，当它们被转录后能结合并使蛋白质因子脱离原结合部位。诱饵型lncRNA（如MALAT1）就像“海绵”一样可以结合和去除转录因子和染色质修饰分子从而负控制基因表达。这种效应将在细胞内引起广泛的“转录组”效应。
3.引导功能
有些lncRNA能引导一些核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein complex）中的分子定位到特别的染色质靶位点。这种效应能通过顺式作用（作用于邻近基因）或反式作用（作用于远处基因）引起基因表达的变化。由于其作用的复杂性，lncRNA的引导功能不容易仅仅通过其序列来预测。具有引导功能的lncRNA的代表有XIST和HOTTIP。
4.参与组成染色质支架
lncRNA支持着复杂的染色质复合物的包装，蛋白质因子结合lncRNA后将形成新的功能。有些lncRNA拥有不同的结构域，可以结合不同的蛋白质因子，从而激活或抑制转录。参与组成染色质支架形成的lncRNA有HOTAIR和ANRIL等。（一）lincRNA的功能
1.通过组蛋白修饰实现基因表达调控
组蛋白（histone，H）是真核生物中一组进化上非常保守的碱性蛋白质，其中碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）约占25%。组蛋白存在于真核生物染色质，分为5种类型（H1、H2A、H2B、H3和H4），后4种各2个形成组蛋白八聚体，构成核小体的核心，占核小体质量的一半。组成核小体的组蛋白的核心部分状态大致是均一的，游离在外的N－端则可以受到各种各样的修饰。
组蛋白修饰（histone modification）是表观遗传调控的重要形式之一，主要的修饰形式有乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等，这些修饰都会影响基因的转录活性。
组蛋白甲基化是由组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够发生单、双甲基化。这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰及其调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys，K）、精氨酸（Arg，R）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位赖氨酸；H3的第2、l7、26位及H4的第3位精氨酸都是甲基化的常见位点。
组蛋白甲基化状态会明显影响到相关基因的表达程度。精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的去甲基化与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化与基因表达程度的关系显得较为复杂，例如：H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4K20的甲基化与基因沉默相关，H3K36和H3K79的甲基化与基因激活有关。同时应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。
有些lincRNA的功能与组蛋白的甲基化修饰有关。主要体现在组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4m3）和第36位赖氨酸的三甲基化（H3K36m3）。H3K4m3和H3K36m3均可激活编码蛋白和ncRNA的表达。
2.通过结合多梳抑制复合物抑制基因表达
研究发现，大约20%lincRNA可结合多梳抑制复合体（polycomb repressive complex，PRC），尤其是PRC2。lincRNA直接结合PRC后形成的复合物（其中包括H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED）能结合到特定的靶DNA片段，然后诱导组蛋白和染色质的结构变化，引起H3K27甲基化，最终抑制相关基因的转录活性。（二）反义lncRNA的功能
与一些linRNA发挥作用时通过反式（trans）作用不同，反义lncRNA的作用方式是顺式（cis）作用。反义lncRNA可通过改变染色质状态影响基因表达。反义lncRNA的转录与编码基因有重叠，但转录的方向的相反。尽管有可能通过正义－反义配对结合形成以小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）机制引起mRNA的降解，但事实上主要是引起正义转录（即蛋白质编码基因）启动子区组蛋白的修饰。反义lncRNA驱动DNA甲基化转移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）到蛋白质编码基因区，然后使组蛋白第9位和第27位赖氨酸或CpG岛甲基化，最终导致转录沉默（图1－12）。有些反义lncRNA也可导致异染色质，如：转录自抑癌基因CDKN2B和CDKN2A的ANRIL可与色素框同源物7 （chromobox homolog，CBX7；PRC1的一个亚基）相互作用而导致异染质形成，然后引起靶基因沉默。lincRNA和反义lncRNA等lncRNA可以归为染色质相关RNA（chromatin－associated RNA，CAR）。因为它们的功能主要依赖于RNA结合基因组DNA的能力和随后调节的染色质状态（常染色质或异染色质）。图1－12 反义lncRNA介导的转录调控A.反义lncRNA由双向转录产生（反义用红色表示，正义用黑色表示）；B.反义lncRNA与正义启动子相关转录子的同源序列结合，或者与未解链DNA的正链相互作用，招募一些染色质重构蛋白——DNA甲基转移酶3a（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）、Ago 1（Argonaute 1，Ago－1）、Zeste增强子（enhancer of Zeste，EZH2）、Suv39h1、组蛋白脱乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC－1）和组蛋白甲基转移酶G9a；C.染色质重构复合物诱导局部染色质结构的变化，包括反义lncRNA靶位点的DNA甲基化
有不少癌基因和抑癌基因表达出反义转录产物（表1－2）。有些在肿瘤发生中起重要作用的基因会产生反义lncRNA。有些抑癌基因在肿瘤中转录沉默的原因可能由反义lncRNA介导。表1－2 产生反义lncRNA的肿瘤相关基因续表（三）分子诱饵
lncRNA的另一个功能是具有“海绵”作用，也称拟态（mimicry）作用或称分子诱饵（molecular decoy），即：lncRNA能诱骗其他RNA或蛋白质离开原始目标，从而降低其功能。lncRNA诱骗作用不仅可以发生在lncRNA－mRNA或者lncRNA－蛋白质之间，还可以发生在lncRNA－miRNA之间。
肝癌高表达转录本（highly up－regulated in liver cancer，HULC）是一些miRNA的拟态，它能够结合并抑制miR－372的活性，显示出内源性“海绵”作用，HULC的表达上调可以抑制miR－372的表达，从而参与了肝癌的发生过程。lncRNA诱骗作用还涉及蛋白质，例如：原先与启动子结合的一些转录因子一旦与生长阻滞特异性转录本5（growth arrest－specific transcript 5，GAS5）结合后离开启动子区，这样就不再具有调控下游靶基因的作用了。这种作用的发挥依赖于GAS5具有类似糖皮质激素受体DNA结合元件的发荚结构。通过同样的原理，GAS5还可以调节其他受体（如雄激素、盐皮质激素和孕酮）。有趣的是，GAS5与糖皮质激素受体的结合还受到糖皮质激素受体激动剂地塞米松的调控。同时，GAS5还受到西罗莫司信号通路中的哺乳动物靶点调节，并可介导西罗莫司在T细胞中的细胞周期影响（图1－13）。
总之，越来越多的证据表明，lncRNA参与广泛的生物学过程，如ANRIL和HOTAIR引起的表观遗传控制；GAS5因分子诱饵作用引起的细胞凋亡和细胞周期改变；MALAT1可调节mRNA的选择性剪接；BACE－1AS导致翻译的抑制等（图1－14）。图1－13 GAS5的功能开放阅读框架（open reading frame，ORF）；糖皮质激素应答元件（glucocorticoid response element，GRE）；5′末端寡聚嘧啶（5′terminal oligopyrimidine，5′TOP）；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）图1－14 lncRNA参与细胞内的多种生物学过程（郭俊明）参考文献
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