作者：孙诗清（主编）
出版社：北京理工大学出版社
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生物分离实验技术试读：
前言
生物分离工程是从动植物、微生物及其基因工程产物中提取分离达到一定标准的有用物质的技术。生物分离的特点之一就是待分离的物质种类繁多。这些物质既包括天然的生物大分子和小分子，也涵盖基因工程改造的产品等。面对众多的生物物质，分离纯化策略的选择就成为了实现其产业化的技术关键。与化工产品的分离纯化相比较，生物物质的分离纯化有以下主要特点：（1）生物材料的组成极其复杂，常常包含数百种乃至几千种化合物。其中许多发挥功能的产物至今还是个谜，有待进一步研究与开发。有的生物物质在分离过程中还在不断地代谢，所以想找到一种适合各种生物物质分离纯化的标准方法是不可能的。（2）许多生物物质在生物材料中的含量极微，只有万分之一或几十万分之一。需要多步的分离纯化操作，才能达到所需纯度的要求。例如，从红豆杉中分离紫杉醇，从脑垂体组织提取释放因子，大多需要吨级生物材料，才能提取出克或毫克级的产品。（3）许多生物物质，尤其是生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活或构象改变，因此分离纯化条件也必须保证产物的基本性质不变，过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都有可能使生物物质的基本性质发生改变，所以分离纯化的条件相对苛刻。（4）生物物质的质量标准高，既要有物理化学性质的要求，也要有生物学性质的测定。同时对于生物实验一般存在较大的批间差异，操作人员的实验技术水平和经验对产品产量和质量会有较大的影响。
针对上述特点，生物物质的分离纯化方法和流程的设计就必须多参考前人的工作，吸取其经验和精华，按照以下的步骤进行某一物质的实验设计。
①确定所要制备生物物质的目的和要求，是用于科学研究还是工业生产，若产业化是出口还是内销，所售地区的该物质标准要求。
②建立相应可靠的分析测定方法，这是分离纯化生物物质的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”，用它来评价每一步的效率。
③通过文献调研和预实验，掌握目标产物的物理化学和生物学性质。
④分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程，需要进行反复的验证。一般在产物的粗分离流程中，选择一些快速、分辨力不高的、能较大地缩小体积和较高负荷能力的方法，如吸附、萃取、沉析法等。在精分离流程中，选择分辨率高、负荷适中、操作简单的方法，如各种色谱分离。
⑤产物的浓缩、干燥和保存。针对不同的产物所采用的方法也是千差万别的，如热敏物质可能就不能选择高温浓缩、气流干燥、常温保存等，可选择膜过滤浓缩、真空干燥或冷冻干燥、低温保存等。
目前，在生物物质的分离纯化方法中，大体从以下几个方面来寻找其差异性，进而达到一定的纯化目的。
①以物质的溶解度差异为依据的方法，如盐析、萃取、分配色谱、沉析和结晶等。
②以物质的分子量大小和形态差异为依据的方法，如差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。
③以物质所带电荷差异为依据的方法，如各种电泳、离子交换色谱等。
④以生物学功能专一性为依据的方法，如酶联免疫、亲和层析等。
根据上述生物物质分离纯化的特点，按照生物物质分离流程进行设计，选择产物与杂质的不同差异性，遵循尽量缩短整个分离纯化流程和提高单元操作的效率及选择性，综合运用化学、工程、生物、数学、计算机等多学科知识和工具，生物物质分离纯化的过程优化一定会取得实质性的突破。
本书由嘉兴学院孙诗清任主编，由嘉兴学院赵永军、湖南工程学院张儒任副主编，参与本书编写的有复旦大学黄德英，嘉兴学院葛志刚、张慧。编写分工如下：孙诗清（第一部分以及第三部分实验五、实验九），赵永军（第二部分实验一至四），葛志刚（第二部分实验五、实验九），张慧（第二部分实验六、实验七）和张儒（第二部分实验十、第三部分实验一至四和实验十）以及黄德英（第二部分实验八、第三部分实验五至八），他们都是长期在教学和科研第一线工作的有经验教师。同时感谢北京理工大学出版社在本书的出版中给予的许多帮助和认真仔细的审阅。
本书主要适用于生物工程及相关专业的本科生，也可供生物相关专业的研究生及科研工作者参考。各个高等学校可以根据自己的实际情况开展部分内容进行科学实验。
由于编者水平有限，书中难免有错误和不足，敬请读者批评指正。|第一部分|液—固分离实验一 高速冷冻离心机的使用方法一、目的要求
1. 了解高速冷冻离心机的结构、使用方法及注意事项。
2. 掌握生物物质、微生物菌体离心分离的原理。二、实验原理
高速冷冻离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器，在实验室分离和制备工作中是必不可少的工具，其最高速度可以达到25 000 r/min，最大离心力可达89 000 g。这类离心机通常带有冷却离心腔的制冷设备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶检测离心腔的温度。高速冷冻离心机有多个内部可变换的转子，它们大多用于收集微生物菌种细胞碎片以及一些沉淀物等。三、仪器与试剂
大肠杆菌发酵液、天平、高速冷冻离心机（图1-1-1）、离心管。图1-1-1 高速冷冻离心机四、实验操作与步骤（1）使用前先检查离心机开关状态，离心管是否泄漏。（2）选择与离心管匹配的转子安装到离心腔内承载转子的轴上。（3）接通电源，打开电源开关。（4）将待离心的发酵液装入合适的离心管中，装液量不宜超过管体积的2/3，盖上离心管盖，精密平衡离心管，并对称地放入转子中。（5）选择离心温度、转子类型、转速和离心时间。（6）完成设置以后，按起动开关，并观察离心机上的各个指示是否正常工作。（7）离心结束后，关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。（8）将转子取出并擦净，将离心机的盖子敞开放置。（9）收集离心物，洗净离心管。五、实验说明（1）高速冷冻离心机的转子是镶置在一个较细的轴上，要求精密的平衡离心管及内含物。（2）当转子只是部分装载时，管子必须相互对称地放在转子上。（3）装载溶液时，要根据离心管的具体操作说明进行，要根据离心液体的性质、体积选择合适的离心管，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转子生锈或者腐蚀。（4）每次使用时，要仔细检查转子，及时清洗、擦干，转子是离心机中须重点保护的部件，搬动时不能碰撞，避免造成伤痕。转子长时间不用时，要涂一层光蜡保护。（5）转子在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转子室内预冷。（6）离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上仪表是否正常工作，并注意声音有无异常，以便及时排除故障。（7）每个转子各有其最高允许速度，使用时注意不能过速使用。六、思考题
1. 影响离心分离的因素有哪些？
2. 如何进行密度梯度离心？
3. 离心操作除能进行液—固分离以外，还能在哪些方面进行应用？实验二 差速离心分离玉米线粒体一、目的要求
掌握差速离心法分离植物线粒体的技术及其应用。二、实验原理
利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近于细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.4的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。三、仪器与试剂
1. 材料
玉米黄化幼苗。
2. 主要试剂和仪器
分离介质：0.25 mol/L蔗糖、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）、3 mmol/L EDTA、0.75 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）；0.3 mol/L甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液、生理盐水。
温箱、冰箱、冷冻控温高速离心机、显微镜、电热恒温水浴锅（图1-2-1）、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、漏斗、小烧杯、表面皿、吸管、吸水纸、纱布。图1-2-1 电热恒温水浴锅四、实验操作与步骤（1）玉米种子用20%NaClO溶液浸泡10 min消毒，清水冲洗30 min，再浸泡清水15 h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2～3 d。待芽长到1～2 cm长时剪下约15 g，放置0℃～4℃冰箱1 h。（2）加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。（3）用多层纱布过滤，滤液经700 g离心10 min。除去细胞核和细胞碎片沉淀。（4）取上清液10 000 g离心10 min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。（5）沉淀为线粒体，可存于0.3 mol/L甘露醇中，注意以上匀浆化及离心均控制在0℃～4℃进行。（6）线粒体的检测：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，立即滴加1%詹纳斯绿B染液染色20 min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。五、实验说明
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。六、思考题
1. 玉米黄化幼苗的制备条件对线粒体的制备有无影响？
2. 细胞核与线粒体的分离除了差速离心以外，还有哪些方法能够进行分离？实验三 恒压过滤常数的测定一、目的要求
1. 掌握恒压过滤常数的测定方法。
2. 学会测定过滤常数K、q、θ及压缩指数S的方法。ee
3. 加深对过滤操作中各影响因素的理解。二、实验原理
过滤是在一定的压力或真空度的作用下，发酵液中的液体通过介质的孔道而固体颗粒被截留下来，从而将发酵液中的液、固两相有效地进行分离的一种常用单元操作。因此，过滤在本质上是流体通过颗粒层的流动，所不同的仅仅是固体颗粒层厚度随着时间的延长而增加，因而在过滤压差不变的情况下，单位时间得到的滤液量也在不断下降，即过滤速度不断降低。其中，过滤速度表示为单位时间内通过单位过滤面积的滤液量，即2
式中A——过滤面积（m）；
θ——过滤时间（s）；3
V——透过过滤介质的滤液体积量（m）；——过滤速度（m/s）。
影响过滤速度的主要因素有压强差ΔP、滤饼厚度L、滤饼和悬浮液的性质、悬浮液温度等。
过滤基本方程式的一般形式为5
式中ΔP——压强差（10 Pa）；2
r'——单位压强差下滤饼的比阻（1/m）；
S——滤饼的压缩指数，无因次；
υ——滤饼体积与相应的滤液体积之比，无因次；
µ——液体的黏度（Pa•s）；2
V——滤液量（m）；2
V——虚拟滤液量（m）；e
其他变量意义同前。
恒压过滤时，对上式积分可得2（q+q）=K（θ+θ）ee32
其中q——单位滤饼面积的滤液量，q=V/A（m/m）；
θ——过滤时间（s）；
q、θ——介质常数，反映过滤介质阻力大小；ee
K——滤饼常数，由物料特性及过滤压差所决定的常数。1-S
K=2k·ΔP，其中。2
将（q+q）=K（θ+θ）微分得，以代替，在过滤ee面积A上对待测的悬浮液进行恒压试验，测出一系列时刻的累计滤液量V，并由此计算一系列q，得到相应的Δθ与Δq之值，在直角坐标系中绘与q间的函数关系，可得一直线，由直线的斜率和截距可求得K和q。e
改变实验所用过滤压强差ΔP，可测得不同的K值，由K值的定义式两边取对数得
lgK=（1-S）lg（ΔP）+lg（2k）
当k为常数时，在对数坐标上标绘的K与ΔP应是一条直线、斜率为（1-S），由此可得滤饼的压缩指数S，然后可求得其他物料特性常数。三、仪器与试剂
加压过膜装置如图1-3-1所示。图1-3-1 加压过膜装置
试剂：50%的石灰水。
实验装置：真空吸滤器、滤浆槽、搅拌桨、缓冲罐及真空泵。
测试装置：计量筒、秒表。四、实验操作与步骤（1）采用小的过滤压强差进行恒压过滤实验。（2）以计量瓶中开始见到清液的时刻作为恒压过滤的零时刻。然后用秒表计时，定时读取计量瓶的液位值，并记录。（3）改变压强差，重复第2步。（4）数据记录，见表1-3-1和表1-3-2。表1-3-1 数据记录表1表1-3-2 数据记录表2（5）对三组实验结果作图，计算K和q。e（6）对lgK=（1-S）lg（ΔP）+lg（2k）作图，计算压缩指数S。五、实验说明（1）压强差的变化在一定的范围内进行。（2）计量桶的流液管口应贴桶壁，防止液面波动影响读数。（3）注意公式换算中的单位一致。六、思考题
1. 为什么过滤开始时，滤液常常有点浑浊，而过一段时间后才变清？
2. 当操作压强增加一倍，K值是否也增加一倍？要得到同样的过滤液，过滤时间是否缩短一半？
3. 滤浆浓度和过滤压强对K值有何影响？实验四 酵母细胞的破碎及破碎率的测定一、目的要求
1. 掌握超声波破碎细胞的原理和操作。
2. 学习细胞破碎率的评价方法。二、实验原理
频率超过15～20 kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250 W）可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超声波细胞破碎机，超声波细胞破碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。其工作原理：超声波发生器将220 W、50 Hz的单相电通过变频器件变为20～25 Hz的交变电能，并用适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械运动，振动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。三、仪器与试剂
1. 仪器
超声波细胞破碎机（图1-4-1）、电子显微镜、紫外—可见分光光度计、酒精灯、载玻片、血细胞计数板、接种针等。图1-4-1 超声波细胞破碎机
2. 试剂
马铃薯培养基（pH6.5）。四、实验操作与步骤
1. 培养基的配制和灭菌
选取优质马铃薯去皮切块200 g，加水1 000 mL煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加蔗糖20 g及琼脂20 g，融化后补充加水至1 000 mL（pH6.5），分装，120℃灭菌20 min。
2. 啤酒酵母的培养（1）菌种纯化。将酵母菌种转接至斜面培养基上，28℃～30℃，培养3～4 d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至50 mL液体培养基中，28℃～30℃培养24 h。（2）扩大培养。将培养成熟的5 mL液体培养基中的酵母菌全部转接至50 mL液体培养基的锥形瓶中，28℃～30℃培养15～20 h。
3. 细胞破碎操作（1）破碎前计数。取1 mL酵母细胞悬液适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。（2）超声波细胞破碎。
①将50 mL酵母细胞悬液放入100 mL容器中，液体浸没超声发射器2 cm。
②打开开关，将频率设置中挡，超声破碎1 min，间歇1 min破碎20次。
③取1 mL破碎后的细胞悬液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。计算细胞破碎率。
④破碎后的细胞悬液，于12 000 r/min、4℃下离心30 min，去除细胞碎片。用考马斯亮蓝法检测上清液中蛋白质的含量。五、实验说明（1）用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。（2）用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞计数，从而算出结果；另一种是间接测定法，将破碎后的细胞悬液离心分离掉固体，然后用考马斯亮蓝法检测上清液中蛋白质含量，也可以评估细胞的破碎程度。六、思考题
1. 细胞破碎的影响因素有哪些？
2. 直接计数法与间接测定法的优缺点各有哪些？实验五 PEG/（NH4）2SO4双水相系统的相图制备一、目的要求
1. 了解用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。
2. 掌握双水相成相的条件和原理。二、实验原理
两种亲水性高聚物或者高聚物与无机盐在水中具有不相溶性，因而某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定，即M（初始混合物组成情况）、T （上相组成情况）、B（下相组成情况），其中T/B互为共轭相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。三、仪器与试剂
1. 试剂
聚乙二醇400、硫酸铵等。
2. 仪器
电子天平、酸度计、温度计、酸式滴定管、试管量筒、烧杯、移液管等。四、实验操作与步骤
1. 双水相系统的制作
精确配制43%（g/mL）的（NH）SO溶液，并测定其密度。另424精确称取PEG400液体0.7 g于试管中，按表1-5-1中所列第一号数据，用吸管加入0.5 mL水，缓慢滴加已配制好的（NH）SO溶液，并在424混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录（NH）SO的加入量，根据密度求出重量。然后按表4241-5-1列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加（NH）4SO溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊24时PEG400和（NH）SO在系统总量中的百分含量。424
2. 相图的绘制
以PEG400的质量分数为纵坐标、（NH）SO的质量分数为横424坐标作图，即得到一条双节线的相图。表1-5-1 相图制作表五、实验说明（1）微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。（2）清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。（3）由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入储液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。（4）滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用（NH）SO滴424定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。六、思考题
1. 思考双水相萃取的成相条件与原理。
2. 双水相体系相图对萃取有何指导意义？
3. 双水相萃取有何优缺点？在蛋白质萃取时会受哪些因素影响？|第二部分|常见生物物质的检测方法实验一 苯酚—硫酸法测定多糖的含量一、目的要求
1. 掌握苯酚—硫酸法测定多糖含量的原理。
2. 学习苯酚—硫酸法测定多糖浓度的方法。二、实验原理
多糖在强酸（浓硫酸）的作用下，水解生成不同的单糖组分并迅速被强氧化剂浓硫酸脱水生成糖醛衍生物，该衍生物可以和苯酚缩合成橙黄色的化合物，并在波长490 nm和一定的浓度范围内，其颜色深浅与糖醛衍生物浓度正相关，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。三、仪器与试剂
万能粉碎机如图2-1-1所示。
蛹虫草子实体粉末：蛹虫草子实体经75℃烘干后粉碎，再过100目筛，干燥保存备用。
葡萄糖标准溶液：精密称取干燥的葡萄糖0.50 g，稀释定容后置于100 mL容量瓶中，充分摇匀，取出1 mL溶液于50 mL容量瓶中定容，制得100 µg/mL葡萄糖标准溶液，备用。
5%苯酚溶液：在60℃水浴中溶解苯酚晶体5 g，加入100 g蒸馏水，混合均匀，放置在棕色瓶中于4℃冰箱中保存备用。
仪器：高速万能粉碎机、电子天平、电热恒温水浴锅、紫外—可见分光光度计。图2-1-1 万能粉碎机四、实验操作与步骤
1. 葡萄糖标准曲线的绘制
分别取备用的100 µg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL至试管中，各加蒸馏水至2 mL，使每支试管中的葡萄糖浓度为0、10、20、30、40、50、60、70 µg/mL。再分别加入5%的苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，充分震荡摇匀，静置5 min后，放入沸水浴中加热15 min，取出后在流动的自来水中迅速冷却。以2 mL蒸馏水代替葡萄糖溶液按同样的显色操作得到的空白试剂为参比，在490 nm波长下测量各组的吸光值。每样需平行3次，取平均值。以吸光度值对应浓度做标准曲线。
2. 未知样品的多糖含量测定
精确称取干燥的10.0 g蛹虫草子实体粉末至烧杯中，按1:30的料液比，加入300 mL蒸馏水，搅拌均匀之后在80℃的恒温水浴中热回流提取1 h，提取两次，将每一次的提取液过滤后混合，减压浓缩至原体积的1/3，加入3倍量的无水乙醇沉淀，静置6 h，抽滤，对沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，干燥称重，命名为虫草粗多糖I。
准确称取50.0 mg虫草粗多糖I使用蒸馏水定容到50 mL容量瓶中，按照葡萄糖标准曲线绘制的方法进行样品的测定，平行测定3次，取平均值，根据换算系数为0.9，代入葡萄糖标准曲线，计算出样品相应的多糖含量。五、实验说明（1）苯酚使用前需要新鲜配制。（2）测定多糖含量要注意换算系数。（3）控制好显色反应的温度和时间。六、思考题
1. 测定多糖的含量方法有哪些？
2. 分析苯酚—硫酸法测定多糖的主要影响因素。实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量一、目的要求
1. 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理。
2. 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的方法。二、实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基与考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下可以结合的原理，使染料的最大吸收峰位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色，这样通过分光光度法可以定量测定微量蛋白的浓度。这种蛋白质测定法快速、灵敏，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。三、仪器与试剂
1. 仪器
10 mL试管6个；试管架1个；0.5 mL、1 mL、5 mL移液管分别2个；恒温水浴箱、分光光度计（图2-2-1）。
2. 材料与试剂（1）待测蛋白质溶液：白菜匀浆液。（2）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1 000 mL。（3）标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。图2-2-1 分光光度计四、实验操作与步骤（1）白菜匀浆液的制备：称取5 g白菜叶用水洗净，吸干表面水分，剪碎，加入25 mL 0.15 mol/L NaCl置于研钵中，0℃～4℃下冰浴研磨15～20 min，8 000 r/min冷冻离心10 min，上清即为白菜叶的可溶性蛋白溶液。（2）制备标准曲线：按照表2-2-1的条件进行混合摇匀后，在25℃下保温10 min，静置5 min，以第一管为空白，在波长595 nm下测定其吸光度值，以标准蛋白的浓度对应吸光度值做线性回归方程。表2-2-1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制（3）样品中蛋白质的测定：样品适当稀释后，另取一干净试管，加入稀释样品1.0 mL及考马斯亮蓝试剂5.0 mL，混匀，在25℃下保温10 min后，静置5 min，于波长595 nm下测定其吸光度值，代入标准曲线中，计算出蛋白质的含量。五、实验说明（1）合理稀释待测蛋白溶液，使测定值在标准曲线的线性范围内。（2）控制好平行之间的标准误差。（3）正确使用分光光度计。六、思考题
1. 考马斯亮蓝法测定蛋白质的优缺点有哪些？
2. 哪些因素会影响测定的结果？实验三 索氏抽提法测定粗脂肪的含量一、目的要求
1. 学习索氏抽提法测定脂肪的原理与方法。
2. 掌握索氏抽提法基本操作要点及影响因素。二、实验原理
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醚或石油醚等溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，蒸去溶剂，所得的物质即为脂肪或称粗脂肪。三、仪器与试剂
1. 仪器
索氏提取器、电热恒温鼓风干燥箱、干燥器、恒温水浴箱。
2. 材料与试剂
花生粉、石油醚、滤纸筒。四、实验操作与步骤（1）样品预处理：准确称取花生粉样品2～5 g（精确至0.01 mg），装入滤纸筒内。（2）索氏提取器的清洗将索氏提取器各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干。脂肪烧瓶在103℃±2℃的烘箱内干燥至恒重（前后两次称量差不超过2 mg）。（3）样品测定：将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，70℃～80℃下提取16 h。提取完毕，取下脂肪烧瓶，回收乙醚或石油醚。待烧瓶内乙醚仅剩下1～2 mL时，在水浴上赶尽残留的溶剂，于95℃～105℃下干燥2 h后，置于干燥器中冷却至室温，称量。继续干燥30 min后冷却称量，反复干燥至恒重（前后两次称量差不超过2 mg）。（4）按表2-3-1记录实验数据。表2-3-1 实验数据（5）按照下述公式计算：
式中 X——样品中粗脂肪的质量分数（%）；
m——样品的质量（g）；
m——脂肪烧瓶的质量（g）；0
m——脂肪和脂肪烧瓶的质量（g）。1五、实验说明（1）抽提温度的控制：水浴温度应控制在使提取液在每6～8 min回流一次为宜。（2）抽提时间的控制：抽提时间视试样中粗脂肪含量而定，一般样品提取6～12 h，坚果样品提取约16 h。提取结束时，用毛玻璃板接取一滴提取液，如无油斑则表明提取完毕。（3）抽提剂石油醚是易燃、易爆物质，应注意通风并且不能有火源。（4）样品滤纸色的高度不能超过虹吸管，否则上部脂肪不能提尽而造成误差。（5）样品和醚浸出物在烘箱中干燥时，时间不能过长，以防止极不饱和的脂肪酸受热氧化而增加质量。六、思考题
1. 简述索氏抽提器的提取原理及应用范围。
2. 潮湿的样品可否采用石油醚直接提取？为什么？
3. 使用石油醚作脂肪提取溶剂时，应注意的事项有哪些？为什么？实验四 茚三酮法测定氨基酸的含量一、目的要求
1. 了解茚三酮与氨基酸反应的原理。
2. 掌握茚三酮显色法测定氨基酸含量的原理。二、实验原理
含有自由氨基的化合物如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时生成氨，氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基的含量成正比，可通过测定570 nm处的吸光度，因而可用比色法测定氨基酸、多肽或者蛋白质的含量。其中氨基酸与茚三酮的反应包含两个重要步骤：第一步，氨基酸被氧化形成CO、NH和醛，茚三酮则被还原成还原型茚三酮；第二步，23形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。三、仪器与试剂
1. 仪器
721型分光光度计、水浴锅、电子天平、pH计、真空泵、试管、滴管、量筒、烧杯、漏斗、铁架台。
2. 试剂（1）标准氨基酸溶液：称取适量赖氨酸，配制成0.3 mmol/L标准氨基酸溶液，并密封保存，以避免被空气中NH3所污染。（2）pH5.4、2 mol/L醋酸缓冲液：量取86 mL 2 mol/L醋酸钠溶液，加入14 mL 2 mol/L冰醋酸，调pH值至5.4。（3）茚三酮显色液：称取85 mg茚三酮和15 mg还原茚三酮，用10 mL乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5 g茚三酮溶于15～25 mL热蒸馏水中，加入0.25 g活性炭，轻轻搅拌。加热30 min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1 mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。（4）60%乙醇。（5）样品液：每毫升水中含有0.5～50μg氨基酸。四、实验操作与步骤
1. 标准曲线的制作
分别取0.3 mmol/L的标准氨基酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用蒸馏水补足至1 mL。各加入1 mL pH5.4、2 mol/L醋酸缓冲液；再加入1 mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，100℃水浴中加热15 min，用自来水冷却。放置5 min后，加入3 mL 60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD吸光度值570 nm（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD）。以440 nmOD吸光度值为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。570 nm
2. 氨基酸样品的测定
取样品液1 mL，加入pH5.4、2 mol/L醋酸缓冲液1 mL和茚三酮显色液1 mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15 min，自来水冷却。放置5 min后，加3 mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定OD（生成的颜色570 nm在60 min内稳定，要求在60 min内完成测定）。根据样品的OD570 nm吸光度值，以标准曲线函数计算样品中氨基酸含量。五、实验说明（1）实验操作时，避免茚三酮与皮肤接触。（2）茚三酮与样品加热后必须用水冷却，之后再进行后续的操作与测定。（3）样品与茚三酮混合后需要充分震荡混匀。（4）标准曲线需要计算回归方程，在使用回归方程时候一定注意其适用范围。六、思考题
1. 为何测定氨基酸含量时，茚三酮与氨基酸反应需要在弱酸性环境下进行？
2. 如果待测样品中含有蛋白质，是否需要除去蛋白质才能测定样品中的游离氨基酸？
3. 思考茚三酮与氨基酸反应可以应用到哪些领域？实验五 活性炭对亚甲基蓝吸附等温线的测定一、目的要求
1. 加深理解吸附的基本原理。
2. 掌握活性炭吸附公式中常数的确定方法。
3. 掌握用间歇式静态吸附法确定活性炭等温吸附式的方法。二、实验原理
活性炭是由含碳物质（木炭、木屑、果核等）作为原料，经高温脱水碳化和活化而制成的多孔性疏水性吸附剂。活性炭具有比表面积大、高度发达的孔隙结构、优良的机械物理性能和吸附能力，因此被应用于多种行业。活性炭吸附通常作为饮用水深度净化和废水的三级处理，以除去水中的有机物。除此之外，活性炭还被用于制造活性炭口罩、家用除味活性炭包、净化汽车或者室内空气等，以上都是基于活性炭优良的吸附性能。在吸附过程中，活性炭比表面积起着主要作用。同时，被吸附物质在溶剂中的溶解度也直接影响吸附的速度。此外，pH值的高低、温度的变化和被吸附物质的分散程度也对吸附速度有一定影响。三、试剂与仪器
1. 仪器
恒温振荡器1台、分析天平1台、分光光度计1台、三角瓶5个、1 000 mL容量瓶1个、100 mL容量瓶5个、移液管。
2. 试剂
活性炭、亚甲基蓝等。四、实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）配制100 mg/L的亚甲基蓝溶液：称取0.1 g亚甲基蓝，用蒸馏水溶解后移入1 000 mL容量瓶中，并稀释至标线。（2）用移液管分别移取亚甲基蓝标准溶液5、10、20、30、40 mL于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至100 mL刻度线处，摇匀，以水为参比，在波长470 nm处，用1 cm比色皿测定吸光度，绘出标准曲线。
2. 吸附等温线间歇式吸附实验步骤（1）用分光光度法测定原水中亚甲基蓝含量，同时测定水温和pH值。（2）将活性炭粉末，用蒸馏水洗去细粉，并在105℃下烘至恒重。（3）在五个三角瓶中分别放入100、200、300、400、500 mg粉状活性炭，加入200 mL水样。（4）将三角瓶放入恒温振荡器上振动1 h，静置10 min。（5）吸取上清液，在分光光度计上测定吸光度，并在标准曲线上查得相应的浓度，计算亚甲基蓝的去除率吸附量。
3. 吸附等温线绘制（1）根据测定数据绘制吸附等温线。（2）根据等温线，确定方程中常数。（3）计算实验数据与吸附等温线的相关系数。五、实验说明（1）实验所得的q若为负值，则说明活性炭明显地吸附了溶e剂，此时应调换活性炭或调换水样。（2）在测水样的吸光度之前，应该取水样的上清液，然后在分光光度计上测相应的吸光度。（3）连续流吸附实验时，如果第一个活性炭柱出水中溶质浓度值很小，则可增大进水流量或停止第二、三个活性炭柱进水，只用一个炭柱。反之，如果第一个炭柱进出水溶质浓度相差无几，则可减少进水量。（4）进入活性炭柱的水中浑浊度较高时，应进行过滤去除杂质。六、思考题
1. 吸附等温线有什么现实意义？
2. 作吸附等温线时为什么要用粉状活性炭？
3. 哪些因素对实验结果影响较大？该如何操作？实验六 3，5-二硝基水杨酸法测定酵母蔗糖酶活力一、目的要求
1. 掌握酶活力测定的基本原理和方法。
2. 学习酶的比活力的计算。二、实验原理
蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热可被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内还原糖的含量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520 nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。
蔗糖酶活力单位（U）表示蔗糖酶在室温（25℃）、pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量。蔗糖酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位U/mg表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。三、仪器与试剂
1. 材料
蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（来源于第三部分实验二）。
2. 试剂（1）1 g/L葡萄糖标准溶液（葡萄糖相对分子量198.17）。（2）0.2 mol/L乙酸缓冲液，pH4.5。（3）5%蔗糖溶液。（4）3，5-二硝基水杨酸试剂。
甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL 10%NaOH溶液中，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255 g酒石酸钾钠加到300 mL 10%NaOH溶液中，再加入800 mL 1%3，5-二硝基水杨酸溶液。
甲乙二溶液相混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中备用，在室温放置7～10 d以后使用。
3. 仪器
恒温水浴箱、可见光分光光度计、1 cm玻璃比色皿；试管、试管架；移液管；微量移液枪（200μL，1 000μL）。四、实验操作与步骤
1. 蔗糖酶活力的测定（1）标准曲线的制作。以还原糖质量浓度（mg）为横坐标，A值为纵坐标，制作标准曲线。520 nm（2）蔗糖酶的酶活力测定。
2. 实验结果（1）实验数据记录和处理，见表2-6-1、表2-6-2与表2-6-3。表2-6-1 标准曲线的制备表2-6-2 数据记录表1（2）根据酶活力计算公式计算蔗糖酶活力和比活力，并比较各步纯化样品的纯度。表2-6-3 数据记录表2五、实验说明（1）酶促反应最适合的pH值为4.5，通常使用pH计进行调节。（2）将配制好的3，5-二硝基水杨酸溶液储存于棕色瓶中。（3）葡萄糖标样要烘干。六、思考题
1. 酶的活力与哪些因素有关？
2. 描述总蛋白、总活力、比活力、蛋白浓度之间的相互关系。
3. 一般酶制剂中酶活力的测定常常采用哪些方法？实验七双 水相系统中蛋白质分配系数的测定一、目的要求
了解蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。二、实验原理
在双水相系统中，生物大分子物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中，当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度比，称为分配系数K，可用下式表示：
K=C/C12
本实验以糖化酶为实验对象，在PEG/硫酸铵双水相系统中进行分配，用考马斯亮蓝比色法测定两相中总蛋白含量，求分配系数。三、仪器与试剂
电子天平、10 mL离心管、台式离心机、移液管、小滴管、50 mL容量瓶和试管及试管架、722分光光度计、记号笔等。
糖化酶、PEG400、硫酸铵、结晶牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、85%磷酸、95%乙醇等。四、实验操作与步骤
1. 实验操作
在10 mL离心管中，用电子天平称取硫酸铵固体1.30 g，PEG400液体2.00 g，用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00 mL，然后加水，直到总量为8.00 g，用橡胶塞塞紧，用力振荡数分钟，使硫酸铵完全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中分配达到平衡，然后，在台式离心机离心3 min，转速3 000 r/min，分别读出上下两相的体积，求相比，并用考马斯亮蓝比色法测定两相中蛋白浓度，求分配系数。
2. 考马斯亮蓝测定蛋白质含量（1）考马斯亮蓝G-250染色液：取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL95%乙醇中，加100 mL 85%磷酸，加水稀释至1 L。（2）标准蛋白溶液：用牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成120μg/mL的蛋白质标准溶液。
标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.060 g结晶牛血清白蛋白，于小烧杯内，加入0.526 g NaCl，溶于少量蒸馏水中，后转入500 mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为120μg/mL。（3）标准曲线的绘制：分别取8支试管，编号，按表2-7-1加入试剂，混匀，室温放置5～30 min。用722分光光度计在595 nm处比色。记录1～6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。表2-7-1 数据记录表（4）样品液的蛋白含量测定。
上相液：吸取上相溶液0.5 mL，用水稀释定容到50 mL，吸取1 mL定容液于试管中，按照上表加入试剂，混匀，室温放置5～30 min，测定吸光度。
下相液：吸取下相溶液0.1 mL，加蒸馏水0.9 mL于试管中，按照上表加入试剂，混匀，室温放置5～30 min，测定吸光度。
根据样品吸光值在标准曲线上查出对应蛋白质含量，再由不同的稀释倍数，计算出上下两相中蛋白质的质量浓度（mg/mL），然后根据K=C/C，计算出分配系数。12五、实验说明（1）测定蛋白含量所用参比溶液分别为上下相未加蛋白样品的溶液。（2）由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。（3）比色皿可以选用玻璃比色皿。六、思考题
1. 双水相萃取分配系数的大小与哪些因素有关？
2. 哪些因素影响吸光度的测定？实验八 胰蛋白酶酶活与比活的测定方法一、目的要求
了解胰蛋白酶酶活的测定方法和原理。二、实验原理
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择。通常利用这样一类人工合成的物质为底物，研究其专一催化活性。因此，本实验采用人工合成的BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯）为底物，进行酶反应来测定胰蛋白酶的活性。水解反应式如下：
在253 nm下，BAEE的紫外吸收值远远小于BA（N-苯甲酰-L-精氨酸）的紫外吸收值。BAEE在酶的催化下，随着酯键的水解，BA逐渐增多，于是反应体系的紫外吸收值也随之相应增加。胰蛋白酶的BAEE单位定义为：引起每分钟光吸收值增加0.003的酶量，规定为一个BAEE单位。三、仪器与试剂
1. 仪器
精密天平、电子台秤、紫外—可见分光光度计、恒温水浴锅、pH酸度计、秒表、移液吸管（或可调式移液管）、烧杯、容量瓶和量筒等。
2. 试剂
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐、NaHPO、KHPO等。2424四、实验操作与步骤
1. 胰蛋白酶酶活的测定（1）pH7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液配制。取0.067 mol/L磷酸二氢钾溶液13 mL与0.067 mol/L磷酸氢二钠溶液87 mL混合，测pH值为7.6。（2）底物溶液配制。在精密电子天平上称取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐12 mg，加水10 mL溶解，用pH7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液稀释成100 mL。制成后应在2 h之内使用。（3）酶活测定方法。将被测酶液用pH7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液适当稀释，精确吸取0.2 mL于比色皿（1 mL）中，再加入3.0 mL底物溶液（底物溶液恒温于25℃±0.5℃），使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃，立即摇匀，同时用秒表计时，并立即放入比色计的槽中，在253 nm波长处，30 s时第一次读取光吸收数值，以后每隔30 s读一次，至3 min。空白对照为底物溶液（BAEE）。
以吸光度值（A）为纵坐标，时间为横坐标作图，每30 s吸光度值的改变应呈线性关系（恒定在0.015～0.018之间），若不符合上述要求，应调整被测酶液的浓度，再作测定。在上述吸光度值对时间的关系图中，取呈线性的吸光度值，酶活按下式计算：
式中 C——每1 mL供试品中含胰蛋白酶的单位数（U/mL）；
A——直线上终止的吸光度值；1
A——直线上开始的吸光度值；2
t——A至A读数的时间（min）；12
0.003——吸光度值每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位；
V——比色皿中酶液加入的体积；
N——酶液稀释倍数。
2. 胰蛋白酶比活的测定（1）用考马斯亮蓝比色法测定原酶液和反萃液中总蛋白的含量（mg/mL）。（2）根据原酶液和反萃液的酶活按公式计算比活。五、实验说明（1）将酶活比色测定时每隔30 s读取的各原始数据列成表格，并按公式计算酶活（U/mL），观察酶活的变化情况，分析实验误差。（2）注意原酶液和反萃液中胰蛋白酶的比活的变化，要求迅速进行反萃取。六、思考题
1. 简述蛋白酶酶活的测定原理。
2. 测定蛋白质含量的方法有哪些？并简要说明。实验九 离子交换树脂的预处理及交换容量的测定一、目的要求
1. 加深对离子交换树脂总交换容量的认识。
2. 掌握离子交换树脂的作用原理以及熟悉静态法、动态法测定离子交换树脂总交换容量的操作方法。二、实验原理
交换容量是离子交换树脂质量的重要标志，本实验测定的是离子交换树脂的总交换量，也叫最大或极限交换量，它是指树脂经过105℃干燥至恒重后，每克或水中每mL树脂具有的可交换离子的总数，单位为毫克当量/克（干树脂）或mL（湿树脂）。离子交换树脂交换量最简单的测定方法是酸碱滴定法。氢型阳离子交换树脂与碱作用时生成水，为一不可逆反应，故可用于静态法测定交换容量。-+-+2
RH→RNa+HO
阴离子交换树脂不能采用类似的方法测定，应用氯型树脂，当它24与NaSO作用时，生成NaCl-，这一反应为可逆反应，故宜采用动态-法测定树脂交换容量，通过测定流出液中Cl含量来计算其总交换容量。三、仪器与试剂
1. 试剂
5%NaOH、5%HCl、0.1 mol/L NaCl标准溶液、1 mol/L HCl标准溶液、1 mol/L NaSO溶液、甲基橙指示剂、KCrO指示剂、蒸馏水、2424717阴离子交换树脂、732阳离子交换树脂、0.1 mol/L AgNO标准溶3液。
2. 仪器
恒流泵、层析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶等。四、实验操作与步骤
1. 离子交换树脂预处理
分别称取2 g 732、717树脂，加水倒入交换柱中，流加50 mL 5%NaOH溶液，流速1滴/s，结束后滴加100 mL去离子水，流速可大一些，结束后再流加50 mL 5%HCl溶液，流速1滴/s，最后流加100
试读结束[说明：试读内容隐藏了图片]