作者：吴立军,王晓波
出版社：人民卫生出版社
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质谱技术在临床医学中的应用试读：
版权页
图书在版编目（CIP）数据质谱技术在临床医学中的应用/吴立军，王晓波主编.—北京：人民卫生出版社，2016
ISBN 978-7-117-22790-2
Ⅰ.①质… Ⅱ.①吴…②王… Ⅲ.①质谱法-应用-临床医学 Ⅳ.①R4
中国版本图书馆CIP数据核字（2016）第138189号人卫智网 www.ipmph.com 医学教育、学术、考试、健康，购书智慧智能综合服务平台人卫官网 www.pmph.com 人卫官方资讯发布平台版权所有，侵权必究！质谱技术在临床医学中的应用主 编：吴立军 王晓波出版发行：人民卫生出版社有限公司 人民卫生电子音像出版社有限公司地 址：北京市朝阳区潘家园南里19号邮 编：100021E - mail：ipmph@pmph.com制作单位：人民卫生电子音像出版社有限公司排 版：人民卫生电子音像出版社有限公司制作时间：2019年4月版 本 号：V1.0格 式：mobi标准书号：ISBN 978-7-117-22790-2策划编辑：杨亚超责任编辑：杨亚超打击盗版举报电话：010-59787491 E-mail：WQ@pmph.com注：本电子书不包含增值服务内容，如需阅览，可购买正版纸质图书。序
质谱技术是一种鉴定技术，最早应用于计量和化学领域，是药物分析、药物代谢等方面研究中必不可少的工具。在临床研究和应用中，质谱联用技术已成为体内药物定量分析的首选技术，广泛应用于临床药物代谢动力学研究。最近几年，质谱技术的应用已推广到临床疾病的诊断和临床药物监测等领域。寻找并研究体内生物标志物并将其应用于疾病的诊断、早期预测以及治疗具有非常重要的意义。质谱联用技术具有高通量、高灵敏度、高专一性，所需样品量少，样品前处理简单，分析速度快，能够多组分同时分析的特点，非常适合对复杂的生物样品进行定量分析。近年来，越来越多的人开始尝试将质谱联用技术应用于临床的疾病诊断、筛查及治疗药物监测，使其临床应用范围越来越广。目前质谱技术已成为专家和学者关注的重点，并且随着质谱技术的发展，其在临床医学领域中将发挥越来越重要的作用。《质谱技术在临床医学中的应用》以临床医学检验和诊断为核心，向读者系统的概述了质谱技术在疾病诊断与药物监测中的应用。本书的编者具有天然药物化学、药剂学、药物分析学、临床药学等教学以及科研经历，能够立足于国家聚焦的科研领域，以医学、药学理论知识为基础，结合自身的实践经验以及最前沿的研究热点，将质谱技术在临床医学中的应用进行总结并以案例的形式进行阐述。《质谱技术在临床医学中的应用》对临床医学、临床药学、临床检验的学者及工作人员均有很好的指导作用和参考价值。哈尔滨医科大学中国工程院院士2016年5月于哈尔滨前 言
质谱技术最先应用于计量和分析化学领域，因其具有灵敏度高、分析速度快、样品用量少、分离和鉴定同时进行等优点，而在其他领域如医学、环境、生命科学、材料科学等都有应用。在全世界都关注人类健康的今天，医学等相关科学技术的发展已成为科学研究中的热点，对疾病诊断、药物监测的精准度和速度有着更高的要求。质谱在临床医学中的应用时间虽然较短，但是由于其具有其他医学技术不可替代的技术优势，使得质谱技术在临床疾病诊断和药物监测的应用中占有越来越大的比重，经查阅近十多年的文献发现，其在常见疾病诊断和药物的监测方面有大量的研究。
本书将质谱技术在临床中的应用进行了全面的整合。主要介绍了质谱技术在临床疾病诊断方面的应用，包括有机酸血症、内分泌疾病、新生儿氨基酸代谢病、中枢神经系统疾病、恶性肿瘤以及糖尿病等疾病的诊断；在药物的监测方面，本书对质谱技术在强心苷类、免疫抑制剂、抗凝血药、抗精神病类药物、雌激素类药物、镇静催眠药、镇痛药以及抗恶性肿瘤等药物监测中的应用进行了总结；除此之外，本书还介绍了质谱技术在蛋白质组学和药物代谢物鉴别方面的应用，同时还介绍了质谱成像技术在有机体内药物分布中的应用。
本书的主要特色包括在临床疾病的诊断和药物监测方面进行了细致全面的总结，这是目前已出版的质谱类书籍所没有涵盖的内容；对质谱在临床医学中的疾病诊断与临床药物监测方面的应用进行了较全面的介绍，具有前瞻性和可操作性；注重理论与实践相结合，使内容更具有逻辑性、层次性、实用性。对质谱技术在常见肿瘤诊断中的应用、在药物监测中的应用以及在质谱成像技术等方面进行了详细的介绍，这是其他质谱类书籍没有涉及的内容。
本书的编者具有天然药物化学、药剂学、药物分析学、临床药学等教学及科研经历，结合自身的实践经验以及最前沿的研究热点，将质谱技术应用总结并编纂成书，相信对临床医学、临床药学、临床检验专业的学生及工作人员均有较高的参考和实用价值。
由于编写水平有限，各位编者教学与科研工作繁忙，书中难免存在疏漏与错误之处，衷心希望读者给予批评指正。编 者2016年2月第一章 质谱技术在临床中的应用简介
质谱（mass spectrum，MS）是样品分子或原子在外部能量作用下电离或电离后进一步分解而生成碎片离子，这些离子在质量分析器（通常是电场或磁场）作用下按照带电粒子的质量对所带电荷之比值的不同而分离排列的图谱，并在此基础上进行各种有机物、无机物的定性和定量分析。质谱的形成过程是气态样品通过导入系统进入离子源，被电离成分子离子和碎片离子，由质谱分析器将其分离并按照质荷比大小依次进入检测器，信号经放大、记录得到质谱图。质谱仪包括进样器、离子化源、质量分析器、控制系统和数据分析系统。质谱仪的核心是离子源和质量分析器。离子源的种类很多，在真空状态下工作的离子源有电子轰击源（electron impact ion source，EI）、化学电离源（chemical ionization，CI）、激光表面解析源（laser desorption，LD）、场解析（软电离）源（field desorption，FD）、快原子（快离子）轰击源（fast atom bombardment，FAB）等；在低压下工作的离子源有电（离子）喷雾（electron/ion spray，E/IS）、电感耦合（inductively coupled plasma，ICP）等离子源。质量分析器的主要类型有磁偏转质谱、四级杆质谱（quad）、离子阱质谱（IT）、飞行时间质谱（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR）等。不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成不同的质谱仪。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有极高的检测灵敏度。自1983年McLafferty等开发串联质谱技术（MS/MS）以来，串联质谱已成为一种成熟的技术，在许多领域特别是在医药临床研究领域发挥着巨大作用。串联质谱法是指质量分离的质谱检测技术，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物进行定性、定量。串联质谱有分离、结构解析同步完成的特点，能直接分析混合物组分，有高度的选择性和可靠性，其检测水平甚至可以达到皮克（pg）级，因此用串联质谱可解决医药领域中的许多问题。色谱-质谱联用技术结合了分离能力强、应用范围广的色谱和灵敏度高、准确性好的质谱优点，同时具有对检测样本处理要求不高、灵敏度高、线性范围宽等优点。根据前端色谱仪的不同，色谱-质谱联用技术包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等。根据后端质谱仪的不同可分为四级杆串联质谱（QQQ/MS）、离子阱质谱（IT/MS）、飞行时间质谱（TOF/MS）、傅里叶变换质谱（FT/MS）等。色谱与质谱部分可以根据需要进行不同的组合，构成不同类型的质谱联用仪，如气相色谱-四级杆质谱联用仪（GC-QQQ/MS）、液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（LC-QTOF/MS）等。一、质谱技术在生物大分子分析中的应用
由于生物大分子如蛋白质、酶、核酸和多糖等具有非挥发性、热不稳定且相对分子质量大等特性，使传统的电离子轰击、化学离子源等电离技术的应用受到极大限制。20世纪80年代出现的软电离技术为质谱在生物大分子的研究领域中开辟了广阔前景。软电离技术的出现，使生物大分子转变成气相离子成为可能，大大提高了质谱的测定范围，改善了测量的灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质谱更适合于分析生物大分子聚合物，如蛋白质、核酸和糖类，开创了质谱分析研究生物大分子的新领域。软电离质谱主要包括电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、基质辅助激光解析电离质谱（matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS）、快离子轰击质谱（fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS）、离子喷雾电离质谱（ion spray ionization mass spectrometry，ISI-MS）、大气压电离质谱（atmospheric pressure ionization mass spectrometry，API-MS）。以上软电离质谱技术中，ESI-MS和MALDI-MS研究最多，应用也最广泛。其可以提供快速的、易解的多组分的分析方法，且灵敏度高、选择性强、准确性好，尤其是在蛋白质组学中的应用越来越广泛。蛋白质组学（proteomics）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学领域中的新学科。基于质谱发展起来的平台有利于研究细胞内蛋白质组分数量的变化，目前质谱越来越多地被用于蛋白质或肽的相对或绝对定量的研究中。质谱可以用来研究蛋白质化学修饰的关键技术，可以定位修饰位点、定量化学修饰蛋白及检测新型结构。定向蛋白质组学是基于质谱技术快速检测目标蛋白的技术，基于质谱的鸟枪蛋白质组学研究是将蛋白质酶解、片段化成肽片段进行质谱分析。质谱在功能蛋白质组学中也有应用。质谱蛋白质组学方法可在鉴定细胞、亚细胞或有机体蛋白质中发挥重要作用，并可提供细胞生物过程和信号传导途径中的重要信息。质谱在核酸和蛋白质的序列分析、结构分析、分子量测定和各组分的含量测定中也有应用，还可用于非共价键结合体如抗原-抗体结合的测定。二、质谱技术在小分子分析中的应用
在小分子生物标志物的临床检测方面，质谱分析的项目主要包括氨基酸、脂肪酸、有机酸及其衍生物、单糖类、前列腺素、甲状腺素、胆汁酸、胆固醇和类固醇、生物胺、脂类、碳水化合物、维生素、微量元素及某些微生物的鉴别等。
GC-MS、GC-TOF/MS不仅能够检测到氨基酸、核苷酸、有机酸、胺类、糖类等极性大的代谢物，而且还能够检测到脂肪酸等极性小的代谢物。也就是说，生物体内的三羧酸循环、糖酵解、磷酸戊糖代谢、尿素循环、脂肪酸代谢、多种氨基酸代谢等多条主要代谢路径的相应成分均能得到检测。因此GC-MS在代谢组学研究中得到了迅速发展，同位素稀释GC-MS也已经成为定量和定性分析小分子的强有力的临床工具，为众多生物小分子的检测提供参考方法。该方法的特点是先用气相色谱对样品进行分离，使绝大部分的样品基质和干扰物质与被测组分相分离，被测组分在载气的带动下经接口进入质谱，从而避免了复杂的样品基质对测定的干扰，保证了质谱定性的可靠性，极大地提高了定量测定的准确性。液相色谱主要有高效液相色谱（HPLC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）等形式。其中超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-QTOF/MS）与传统的HPLC相比，具有分析速度更快、分离效率更高的优点，近年来逐渐成为代谢组学研究的常用方法。毛细管电泳-串联质谱法（CE-MS）兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，基本原理是根据在电场作用下离子迁移速度不同而对组分进行分离和分析。CE-MS可检测多种生物样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液、组织及实验动物活体等。与LC-MS和GC-MS相比，CE-MS的分辨率更高、分析速度更快、所需检测的样品和底液量更少。三、质谱技术在临床疾病诊断中的应用
生物体是体液、细胞和组织中的代谢物处于动态平衡的完整体系，当机体产生疾病时，病理状态下的机体会引起一些内源性代谢物的种类及浓度发生改变，应用代谢组学技术对其进行全面分析，可为临床诊疗提供依据。
代谢组学（metabonomics）是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的以定量描述生物体内的代谢物多参数变化为目标的新兴“组学”，是系统生物学的重要组成部分。其关注的是代谢路径中相对分子质量在1000以下的小分子代谢物的变化，反映受外界刺激或遗传修饰下细胞或组织的代谢应答变化。色谱-质谱联用技术对于样本中浓度相差大的代谢化合物可达到很好的检测效果，已成为代谢组学研究技术平台中愈加重要的方法。首先，质谱联用技术在肿瘤代谢组学的研究中得到了广泛应用。由于遗传学和表观遗传学的基因突变，从而导致肿瘤细胞的代谢表型发生改变，其异常代谢所产生的中间产物和终产物均可作为肿瘤发生和发展的标志物，因此运用代谢组学技术从机体的代谢途径中寻找肿瘤特异性代谢产物已成为国内外学者研究的热点。应用生物质谱技术检测肿瘤标志物是临床诊断肿瘤的重要检验方法。由于恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，所以人们一直在研究其早期诊断方法，肿瘤标志物的检测就是其中的一个主要方法。通过LC-MS法对健康女性和患有卵巢上皮细胞癌的患者血清进行代谢组学分析，发现27-nor-5β-cholestane-3，7，12，24，25-pentolglucuronide（CPG）可以作为潜在的肿瘤标志物的代谢产物，与CA125相互补充，有利于卵巢上皮细胞癌的早期诊断。采用GC-MS法对肺癌患者及其他肺部疾病患者的血清及尿液进行代谢组学分析，发现血清中有13种差异代谢标志物、尿液中有7种差异代谢标志物。利用GC-TOF/MS法对肾细胞癌患者进行代谢组学分析显示，与正常组织相比，原位肿瘤组织存在α-生育酚、马尿酸、肌醇、1-磷酸果糖等代谢异常；远端转移肿瘤组织存在花生四烯酸、游离脂肪酸、脯氨酸等代谢异常。检测尿液中的α-生育酚有可能成为肾细胞癌肿瘤组织与非肿瘤组织的鉴别方法，得到18种尿液代谢标志物，其中包括辛二酸、庚二酸、乙二酸、甘氨酸、木糖醇、尿素、磷酸盐、丙酸、嘧啶、苏氨酸、丁二酸、丁酸、三羟基戊酸、次黄嘌呤、酪氨酸、阿拉伯呋喃糖、羟基脯氨酸二肽和木糖酸。结合血清传统标志物甲胎蛋白的检测结果建立诊断模型，大大提高了临床诊断的准确性。
其次，质谱联用技术在肝肾疾病代谢组学研究中也有应用。通过UPLC-QTOF/MS技术和多变量数据分析证实，纤溶酶LPCs是区别酒精性肝损伤和肝癌的生物标志物。采用UPLC-TOF/MS研究暴露于不同浓度的全氟辛酸（PFOA）72小时的正常人L-02肝细胞内代谢谱的变化，筛选出18种与全氟辛酸毒性密切相关的生物标志物，包括肉碱和酰基肉碱、核苷及其同源物、氨基酸及其同源物等。Oresic M等应用UPLC-MS与GC-TOF/MS技术，分别对精神分裂症患者血浆内的脂质和小分子极性代谢物进行分析表明，患者体内的糖代谢和脯氨酸代谢异常可能是与该病有关的两条代谢途径。采用UPLC-QTOF/MS技术对孤独症儿童的血清进行代谢组学分析，共鉴定出14个潜在生物标志物，其中鞘脂类和溶血磷脂类物质在孤独症儿童组明显增多，而不饱和脂肪酸和脂酰肉毒碱明显减少。用UPLC-QTOF/MS技术分析高尿酸血症患者的血浆代谢物图谱，发现有6种质荷比较小的代谢物是区分高尿酸血症患者与健康人群的潜在标记物，主要包括脂肪酸和短肽等。
质谱联用技术在中医证候代谢组学中也有较好的应用。从整体观念来看，证候是由外源性刺激（外邪）或基因变异（内因）所致的病理变化过程，该过程使生物代谢网络和细胞产生的内源性物质的种类、浓度、相对比例发生扰动，体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。而代谢组学正是通过考察这种改变来揭示病理状态变化规律，非常符合中医整体观念和辨证论治特点的需要。通过GC-MS及模式识别为主的代谢组学方法对慢性心力衰竭（CHF）肾阳虚证患者的代谢模式进行了研究。通过PCA模式识别，慢性心力衰竭肾阳虚证组、非肾阳虚证组与正常组的主成分积分（枸橼酸、丙氨酸、3-甲基戊烯二酸、丙胺、组胺）在空间分布上明显分开，证实慢性心力衰竭肾阳虚证患者、非肾阳虚证患者和正常人具有不同的代谢模式。用LC-TOF/MS对高血压肝阳上亢证患者进行主成分分析，通过Metlin数据库鉴定相关代谢物及代谢通路，结果PCA得分图中健康志愿者的数据离散度较大，而阴阳两虚证组和肝阳上亢证组的数据则呈聚集，两证候组的数据在空间上分离良好，组间存在较大差异，共鉴定出6种代谢物：雌二醇、白三烯、葡萄糖神经酰胺、神经酰胺、甘油三酯及甘油二酯，或能成为两种高血压证候的鉴别点。采用GC-MS对冠心病（CHD）心血瘀阻证组、CHD非心血瘀阻证组、健康对照组进行血浆代谢产物PCA分析。通过PCA积分三个实验组分别聚于椭圆形散点图的三个区域，花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、枸橼酸、β-羟基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸为CHD心血瘀阻证患者血浆中的重要指标性代谢产物。
遗传性代谢疾病（inherited metabolic diseases，IMD）又称为先天性代谢缺陷疾病（inborn errors ofmetabolism，IEM），是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏引起一系列临床症状的一组疾病。新生儿疾病筛查（newborn screening）是指在新生儿期对某些危害严重的先天遗传代谢性疾病进行群体筛检，使患儿得到早期诊断和治疗，避免智能残疾的发生，提高人口质量。此类疾病在新生儿期甚至在小婴儿期常缺乏特异性症状，一旦出现症状患儿已发生中枢神经系统的不可逆性损伤，失去了最佳治疗时机。而患儿在新生儿期血液内的生化、代谢等指标已有变化，因此可利用实验室检测方法作出早期诊断。新生儿疾病筛查是现代预防医学的重要内容，对优生优育、提高人口素质具有深远而积极的意义，也是从根本上降低出生缺陷、提高人口质量的重要措施之一。从苯丙氨酸的细菌抑制法至荧光定量检测，干血斑促甲状腺激素（TSH）检测法中的放免法、酶联免疫吸附法（ELISA）、时间分辨荧光免疫法（DELFIA）的演进，到干血斑的MS/MS分析技术，新生儿疾病检测技术不断改进，可检测的病种逐渐增多，检测效率和准确度也大大提高。串联质谱技术可通过一次进样检测多种疾病，极大地拓展了IMD筛查的种类。目前已可以用此技术检测的IMD包括氨基酸代谢紊乱、有机酸尿症、尿素循环障碍及脂肪酸氧化缺陷（酰基肉毒碱缺乏）等。四、质谱技术在治疗药物监测中的应用
治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）是指通过各种现代测试手段，测定血液或其他体液中的药物及其代谢物的浓度，探讨患者体内的血药浓度与疗效及毒性反应的关系，从而确定有效及毒性血药浓度范围。应用药动学原理调整给药方案，包括最适合的剂量、给药间隔及给药途径，提高疗效和减少不良反应，达到安全、有效的个性化治疗的目的，以避免体内药物浓度过低所致的治疗失败或体内药物浓度过量导致毒性反应。需要进行临床监测的药物主要包括以下几类：第一类为治疗指数低、毒性大的药物，如地高辛、氨茶碱、环孢素、氨基糖苷类抗生素、锂盐等。第二类为药物动力学呈非线性特征的药物，这类药物随剂量增大血药浓度可不成比例地猛增，并伴以半衰期明显延长，如苯妥英钠、普萘洛尔、阿司匹林等。第三类为需长期使用的药物，易出现慢性中毒或达不到血药浓度，常不易觉察，如抗癫痫药等。第四类为需要优化个体化给药方案的药物，如患有肝、肾、心脏和胃肠道等脏器疾病的患者使用的药物，这类药物在体内的药物动力学参数可发生显著改变。如胃肠道疾病可影响口服药物的吸收；心力衰竭患者由于肝、肾血流量减少而影响药物的代谢；肝功能不良者可使药物的代谢速率降低，并减少与血浆蛋白的结合；肾功能不良可影响药物的排泄。因此，这些患者应进行血药浓度监测，随时调整给药方案。第五类为过量后中毒症状与原疾病本身的症状类似的药物，如苯妥英钠中毒引起的抽搐与癫痫发作症状相似，不易区别，这类药物需要进行药物监测。第六类为合并用药时常需要进行药物监测。由于药物的相互作用而引起药物的吸收、分布或代谢的改变，通过血药浓度监测，可以有效地作出校正。
原有药物监测主要使用免疫化学技术和高效液相色谱技术。临床上多采用免疫化学技术，该技术简单易行，但是所测定的药物种类比较少；高效液相色谱技术测定的药物种类较多，但是定性的可靠性差，专属性比较低。色谱-质谱联用技术监测药物准确、快速、灵敏度高，几乎可以用于所有药物的监测，如强心苷、抗心律失常药、抗癌药、免疫抑制剂、抗生素等，所以色谱-质谱联用技术在治疗药物监测中将具有广泛的应用前景。五、质谱成像技术在临床上的应用
质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）是一种新型的分子成像技术，它将质谱的离子扫描过程与专业的图像处理软件相结合，对样本表面分子或离子的化学组成、相对丰度及空间分布情况进行全面、快速的分析，应用这一技术，可以直接从生物组织切片表面获得多种蛋白质或小分子代谢物的空间分布信息。这种原位分析技术的原理是利用激光或离子束使组织切片表面的分子离子化，然后通过质谱测定这些离子化分子的质荷比（m/z），再由软件重构出分析物在组织中分布的图谱。该技术最早于1997年被应用于研究生物组织中蛋白质的分布。目前MSI技术已广泛用于蛋白质识别、生物标志物发现、医学诊断等研究。MSI技术在疾病机制的研究中也有广泛的应用，例如对阿尔茨海默病患者的脑组织进行质谱成像分析发现两个具有特征分布的多肽，多肽m/z4330.9主要集中分布于颅顶骨、枕骨的皮质突出部，多肽m/z4515.1主要集中于海马区。进一步鉴定这两个组分，发现它们均为淀粉多肽。阿尔茨海默病的病理特征是在老年斑和血管壁上会出现淀粉多肽的沉积物，因此，研究者推测这些多肽的分布与阿尔茨海默病的发病机制有关。该技术可在无标记的条件下研究蛋白质或代谢物在组织中的分布，有助于了解疾病产生、转移和预后的机制。MALDIMSI技术还可用来划分肿瘤组织与周围正常组织的界限，可作为染色得到的组织学信息的补充。通过研究小叶状乳腺癌、胃肠道的环状体癌、胆管癌等生物组织中的癌细胞位置，当在显微镜下见不到明显可辨认的病理区域时，可使用质谱成像技术找出癌细胞侵袭区域，指导手术切除。
总之，自从质谱技术应用到临床以来，便以高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力，尤其和气相、高效液相色谱仪的联用极大地扩展了质谱技术在临床中的分析范围。（吴立军）参 考 文 献
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［3］ Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）：153-161.第二章 质谱技术在有机酸血症诊断中的应用第一节 概 述一、有机酸血症简介
有机酸血症（organic academia/aciduria，OA）主要是指由于氨基酸、脂肪酸和糖代谢异常导致中间代谢产物——有机酸增加，从而引起一系列病理生理改变。多数为常染色体隐性遗传病，包括甲基丙二酸血症、丙酸血症、异戊酸血症、生物素酶缺乏症和多种羧化酶缺乏症。有机酸是氨基酸、脂肪酸、类固醇、碳水化合物或者某些药物在体内代谢的中间产物，由于代谢途径中某种酶的缺陷，导致其中间代谢产物和旁路代谢产物增加，最终导致有机酸血症。由于代谢过程中大部分有机酸需与辅酶A结合成酰基辅酶A才能逐步代谢，而有机酸血症的患者体内大量酰基辅酶A累积，酰基辅酶A与肉碱结合形成酰基肉碱，故有机酸血症患者体内相应的酰基肉碱也会大量增加。二、目前临床诊断有机酸血症的方法
1.酶学分析法
常用培养外周血白细胞或皮肤成纤维细胞的方法进行酶活性测定，以确定酶缺陷类型。
2.基因检测
根据基因突变分析进行确诊。
3.其他
辅助诊断方法包括影像学检查、脑电图和产前诊断等。三、质谱技术在有机酸血症诊断中的应用
近年液相色谱-串联质谱技术和气相色谱-串联质谱技术已广泛应用于遗传代谢病的诊断和新生儿筛查中，通过监测干血滤纸片中氨基酸和酰基肉碱的水平来筛查不同的氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢病。美国北卡罗来纳大学最先将串联质谱分析技术应用到新生儿疾病筛查中，并于1997年开始成立一个试点项目，在全州范围内研究脂肪酸氧化、有机酸和氨基酸酸紊乱的发病率和筛查情况。串联质谱主要通过监测血液中不同的酰基肉碱浓度来进行诊断和筛查有机酸血症，对于仅有丙酰肉碱（propinoylcanIitine，C3）增高的患儿，应首先分析是否伴有游离肉碱（C3/C0）（C0为游离肉碱）或乙酰肉碱（C3/C2）（C2为乙酰肉碱）比值的增高，以便排除C3增高的假阳性；其次分析是否伴有甘氨酸（glycine，Gly）增高，若伴有Gly增高可能为丙酸血症（propionic acidemia，PA），若不伴有Gly增高则可能为甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）。如图2-1所示为正常儿童和丙酸血症（propionic acidemia，PA）、甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）、异戊酸血症（isovaleric acidemia，IVA）、戊二酸血症（glutaric acidemia，GA）Ⅰ型患儿的串联质谱图，疾病对应参数的离子峰强度显著增高，与定量结果一致，PA和MMA均表现为C3离子峰强度增高，PA患儿C3增高更显著。
为了探讨串联质谱技术在遗传性代谢病高危儿童有机酸血症筛查和诊断应用中的意义，韩连书等人使用串联质谱技术对1000例遗传性代谢病高危儿童的血样进行了监测，在1000例高危儿童的筛查中确诊有机酸血症的有40例，如表2-1所示。其中甲基丙二酸血症最多，为20例（50%）；其次为PA 6例（15%），异戊酸血症（isovaleric acidemia，IVA）3例（7.5%），戊二酸血症（glutaric acidemia，GA）Ⅰ和Ⅱ型各3例（7.5%），生物素酶缺乏症2例（5%），3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-methylcrotonyl-CoAcarboxylase deficiency，3-MCC）、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyase deficiency，3-HMC）及β-酮硫解酶缺乏症各1例（2.5%）。图2-1 串联质谱图谱a：正常儿童；b：丙酸血症（C3：丙酰肉碱）；c：甲基丙二酸血症；d：异戊酸血症（C5：异戊酸肉碱）；e：戊二酸血症Ⅰ型（CSDC：戊二酰肉碱）表2-1 40例有机酸血症患儿的串联质谱筛查结果注：C3：丙酰肉碱；C5：异戊酰肉碱；C5DC：戊二酰肉碱；C5-OH：3-羟基异戊酰肉碱；C5：1：异戊烯酰肉碱；C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；羟基异戊酰肉碱；Gly：甘氨酸
根据有机酸血症的发病机制，对于一些有机酸血症，使用串联质谱技术可明确诊断。例如C5显著增高可诊断为IVA，C5DC单独增高可诊断为GA-Ⅰ型，多种酰基肉碱增高可诊断为GA-Ⅱ型（又称为多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症），甲基丙二酰肉碱（methyl malonyl carnitine）和C3同时增高可诊断为MMA，C5-OH和C3同时增高可诊断为多种羧化酶缺乏症。有些不同有机酸血症可能表现出同一种酰基肉碱增高的情况，如PA和MMA均为C3增高，但根据发病机制可加以排除，由于PA直接引起C3增高，而MMA间接引起C3增高，所以理论上当PA发病时C3增高更显著，这在研究串联质谱的C3检测结果中得到证实。当C3>30μmol/L时基本可排除MMA，诊断为PA；当C3<15μmol/L时基本可排除PA，诊断为MMA；当C3介于15～30μmol/L时需进行尿有机酸分析来鉴别。至于MMA患儿，甲基丙二酰肉碱（C4DC）不增高的原因可能与甲基丙二酰辅酶A不易与肉碱结合有关。虽然生物素酶缺乏症或多种羧化酶缺乏症中也有C3增高的情况，但会同时伴有3-羟基异戊酰肉碱（C5-OH）增高，且以C5-OH增高为主，C3-C0和C3-C2正常，而MMA和PA患儿则C3-C0和C3-C2显著增高，故易与PA或MMA相鉴别。对于3-MCC、3-甲基戊烯二酰辅酶A水解酶缺乏症和3-HMC疾病，串联质谱分析均表现为C5-OH增高，且增高的程度无显著性差别，故单用串联质谱仅可提示为这三种疾病中的一种，需要对尿液进行气相色谱分析进行鉴别。
由于血中的酰基肉碱属微量物质，结合其结构特点，常规的实验室方法较难测定。目前临床主要采用气相色谱-质谱对尿液样品进行分析进而对疾病进行诊断。第二节 质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用一、甲基丙二酸血症简介
甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）是一种常见的有机酸血症，属于常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（methyl malonyl coenzyme A mutase，MCM）或其辅酶钴胺素（coenzyme cobalamin）代谢缺陷所致。甲基丙二酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸分解代谢途径中甲基丙二酰辅酶A的代谢产物。正常情况下在MCM和维生素B12的作用下转化生成琥珀酸，参与三羧酸循环。MCM缺陷或维生素B12代谢障碍导致甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，从而引起神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤。钴酰胺（cobalamide，Cbl）和甲基钴胺素（methyl cobalamin，MeCbl）是甲基丙二酰辅酶A（methyl malonyl coenzyme A，CoA）线粒体异构化成为琥珀酰辅酶A和同型半胱氨酸的胞质甲基化成蛋氨酸的过程中的重要辅酶，缺乏这两种辅酶会导致甲基丙二酰辅酶、变位酶和蛋氨酸合成酶的活性减小，血浆和尿液中的甲基丙二酸和同型半胱氨酸浓度增加、蛋氨酸浓度降低。二、目前临床诊断甲基丙二酸血症的方法（一）临床诊断
甲基丙二酸血症患儿的临床表现各异，往往容易误诊，最常见的症状是反复呕吐、嗜睡、惊厥、运动障碍、智力及肌张力低下。根据维生素B负荷试验，即连续3天肌内注射维生素B，若症状好转、1212生化异常改善，则为维生素B有效型，无改善则为无效型。维生素12B无效型是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由变位酶缺陷引起。12出生时可能是正常的，但会迅速发展为嗜睡、呕吐并伴有脱水，出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下等。此外，也有一些无症状的“良性”甲基丙二酸血症患者，尿中的甲基丙二酸排泄量轻度增加，但其一级临床表现还有待于进一步的研究。（二）实验室诊断
1.实验
可见代谢性酸中毒、乳酸增加、电解质紊乱，白细胞、血红蛋白及血小板减少，血糖降低、血氨升高，尿酮体及尿酸升高，肝肾功能异常等。
2.酶学分析
可通过对成纤维细胞、外周血淋巴细胞或肝组织成纤维细胞的酶活性检测及互补试验等分析确定MMA酶缺陷类型。
3.基因检测
基因突变分析是MMA分型最可靠的依据。其中MCM编码基因为MUT，定位于6p21.1；cblA基因被定义为MMAA，位于4q31.1～q31.2；cblB基因定义为MMAB，定位于12q24；cblC编码基因命名为MMACHC，位于1p34.1。通过对以上几种类型的基因突变的检测，可以明确分型。
4.其他
辅助诊断方法包括影像学检查、病历活检、脑电图和产前诊断。三、质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用
以往有机酸血症的诊断多依赖生化与分子生物学方法，随着人类疾病谱的改变和对天生性缺陷病的重视，串联质谱技术得到了迅速发展。该技术可高效、快速地分析干血滤纸片上的氨基酸谱和酰基肉碱谱，为临床诊断提供重要的技术支持，提高了遗传性代谢病筛查和检验的准确性。
通过气相色谱-质谱检测尿、血、脑脊液中的有机酸和串联质谱检测血中的C3含量是确诊本症的首选方法。MMA患儿尿液中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸和3-羟基丙酸会显著增加，血液中的C3、C3/C0和C3/C2会升高。在单纯的甲基丙二酸血症患儿中，血液中的甲基丙二酸浓度为220～2900mmol/L（正常值<0.2mmol/L）。部分患儿的脑脊液中可检测到与血浆中等量的甲基丙二酸。在甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的患儿中，显示血清和尿液中的同型半胱氨酸浓度增高，可与单纯甲基丙二酸血症患儿进行区别。
实例：
串联质谱技术在甲基丙二酸血症诊断中的初步应用
样品来源：
所有样品均来自于临床遗传性代谢病患儿，年龄为2天～14岁，共162例。
实验仪器：
API2000型串联质谱仪购自美国生物应用系统公司（Applied Biosystems），高效液相仪采用美国安捷伦公司（Agilent 1100）的产品，GC-MS分析为安捷伦5890/5973N型，96孔板加热吹干装置为Techne Dri-Block DB-30。
色谱及质谱条件：（1）GC-MS：
GC-MS配备 7673型自动进样器，HP-5毛细管色谱柱，柱长 30m，直径0.32mm，膜厚0.25μm，无分流式进样，进样口温度250℃。氦气为载气（1ml/min），界面温度250℃。质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式（EI 70eV），质荷比（m/z）范围50～600，扫描周期0.4秒。色谱柱箱程序升温从60℃开始，20℃/min升温至90℃后停留4分钟，然后以8℃/min升温至300℃，样本分析时间为30分钟。（2）LC-MS：
LC-MS分析的流动相采用80%乙腈，四元泵的流速设置为3μl/min，自动进样器设置为每次进样20μl。每次测定采用3种扫描方式进行检测。中性氨基酸采用中性丢失扫描方式（neutralloss scan），中性丢失片段的质荷比（m/z）为102，扫描范围为m/z 140～280，子离子为 m/z 85片段，扫描范围为 m/z 210～502；甘氨酸（glycine，Gly）、鸟氨酸（ornithine，Orn）、精氨酸（arginine，Arg）、瓜氨酸（citrulline，Cit）采用多反应监测（multiple reaction monitor，MRM），一个样品的测试时间约为2分钟。
样品前处理方法：（1）GC-MS分析：
干燥滤纸尿样用小于2ml的去离子双蒸水分次离心洗脱测定肌酐含量。取相当于2.5μmol肌酐的原尿，洗脱尿样，加入50μg内标十五烷酸和2-酮己酸，与100μl盐酸羟胺、200μl0.25mol/L硫酸、500μl饱和氯化铵混合45分钟以完成α-酮酸的肟化反应，然后分别用3ml乙酸乙酯和乙醚两次萃取，合并有机溶剂相，并用无水硫酸钠去除残余水分，加入外标C24，用纯净氮气吹干后，加入100μl甲基硅烷化衍生剂，置于干燥加热器上60℃衍生60分钟，冷却后用正己烷稀释至500μl。取1μl上样，进行GC-MS分析。（2）LC-MS分析：
将干血滤纸片用打孔器制成直径3mm的圆形滤纸血片（相当于3.2μl全血），置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100μl，室温放置20分钟，萃取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后离心至另一个96孔聚丙烯板中，50℃加热吹干，再加入60μl盐酸-正丁醇，用Teflon膜覆盖后置于65℃恒温箱内15分钟，50℃加热吹干，再加入80%乙腈100μl溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。
数据处理：
定量分析采用软件ChemoView 1.2版本（美国生物应用系统公司），根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸与酰基肉碱的离子峰强度，自动计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度。
结果分析：
MMA患者与对照组的SIM色谱图如图2-2所示，儿童尿液气相色谱-质谱及血串联质谱检测结果见表2-2。MMA患者组尿中的甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平及血中的C3、C3/C2水平均超出正常参考值上限，且显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。162例患者的尿甲基丙二酸水平均高于正常参考值上限，145例患者的尿甲基枸橼酸水平超出正常参考值范围。MMA组患者血液中的C0、C2、Met水平虽低于对照组（P<0.01，表2-2），但仍处于参考值范围内。162例MMA患者中15例血液中的C3水平正常，而C3/C2高于参考值上限及对照组，差异有统计学意义（Z=6.455，P<0.01）；气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平显著增高，与对照组相比差异均有统计学意义（分别为Z=8.533和5.896，P<0.01），经基因检测确诊。表2-2 MMA患者与对照组儿童的尿液气相色谱及血串联质谱检验结果比较注：MMA：甲基丙二酸血症；C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；C3：丙酰肉碱；Met：蛋氨酸图2-2 干血滴样本中对照组与MMAU患者的典型MMA SIM色谱图（A）对照组，浓度为 0.56nmol/ml；（B）MMAU 组，浓度为 67.7nmol/ml第三节 质谱技术在丙酸血症诊断中的应用一、丙酸血症简介
丙酸血症（propionic acidemia，PA）是一种较常见的支链氨基酸和偶数链脂肪酸代谢异常的有机酸血症，为常染色体隐性遗传病，原因是丙酰CoA酶羧化酶（propionyl-coenzyme A carboxylase，PCC）活性缺乏，导致体内的丙酸及其代谢产物异常蓄积而出现的一系列生化异常、神经系统和其他脏器损害的症状。PA的临床表现个体差异大，多数患儿在出生1个月内起病，临床表现为喂养困难、反复呕吐、嗜睡等。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的应用，越来越多的PA患儿得到诊断和早期治疗。二、目前临床诊断丙酸血症的方法
由于PA的临床表现缺乏特异性，临床误诊率高，因此对于原因不明、反复发生呕吐、惊厥、难以纠正的酸中毒、昏迷和发育落后，尤其有类似家族史者应考虑到本病。应对患儿及早进行血尿常规、血气分析、血氨、血乳酸、血糖和心肌酶谱等一般生化检查，并尽快留取血滤纸片进行串联质谱酰基肉碱分析，留取尿液进行气相色谱-质谱有机酸分析。
1.特殊生化诊断
患者的串联质谱检测结果显示血样中的丙酰肉碱、丙酰肉碱与游离肉碱比值、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值及甘氨酸水平均增高；若气相色谱-质谱检测结果显示尿样中有大量的甲基枸橼酸、3-羟基丙酸和丙酰甘氨酸时，即可诊断为丙酸血症。
2.基因诊断
随着丙酸血症分子遗传学的研究进展，快速的基因诊断和进一步的产前诊断已成为可能。丙酰CoA酶羧化酶为α和β亚单位组成十二聚体，编码基因分别为PCCA和PCCB，PCCA突变位点主要集中在外显子13、12、19和18，PCCB突变位点多发生于外显子 12、15、11 和 6。
3.产前诊断
测定培养的羊水细胞、绒毛膜组织酶活性、突变基因，或羊水中甲基枸橼酸的水平可直接进行产前诊断。对未受损的绒毛膜细胞或培养的羊水细胞进行酶活性和基因突变分析，在7～10天可得到结果，该产前诊断方法快速可靠。当胎儿丙酰CoA活性缺乏时，羊水中的甲基枸橼酸水平为正常水平的20～30倍。三、质谱技术在丙酸血症诊断中的应用
PA早期或晚期发病可引起严重的永久性的神经损伤，神经损伤的程度与高血氨的水平相关。尿液气相色谱-质谱和质谱可以进行明确的诊断。
实例：
气相色谱-质谱仪检测丙酸血症
样品来源：
样品为来自于248例临床患者病理状态下的尿液，另外再取对照组250例，患儿的年龄为1～10天。
实验仪器：
岛津QP-5000 GC/MS仪，分析毛细管柱（30m×0.25mm，J&Wfused silica）。
色谱条件：
应用安捷伦5890/5973N型GC-MS进行样本分析，质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式（EI 70eV），质荷比（m/z）范围为50～600，扫描周期为0.4秒。分析毛细管柱的温度从125℃开始，以16℃/min升温到325℃。
样品前处理方法：
取病理状态下的患者尿液0.1ml加尿素酶1mg，温浴除去尿素，然后加入0.9ml乙醇，混合，离心除掉蛋白。取上清液蒸发，再经氮气完全吹干。最后按10∶1的比例加入0.1ml N-O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide（BSTFA）和trimethylchlorosilane（TMCS），在80℃30分钟条件下萃取后，取60μl装瓶进行GC/MS检测。
结果分析：
健康志愿者与患者尿液的色谱图如图2-3所示。丙酸血症发作时尿中出现大量3-羟丙酸、甲基枸橼酸、甘氨酸，尿中的乳酸含量也会增高。患者筛查结果（表2-3）显示还可出现微量的异常代谢产物，如3-羟基-3-甲基-3-戊二酸、2-甲基-丁酰甘氨酸、2-甲基-乙酰乙酸、2-甲基-3-羟丁酸、2-甲基-戊烯二酸、2-羟基-2-甲基-丁二酸、3-甲基-己二酸和戊二酸。尿中的3-羟丙酸和甲基枸橼酸在发作期和缓解期均可检出，这是本病化学诊断的最主要的指标。丙酸血症和甲基丙二酸血症患者的临床表现相似，且尿中均可测出甲基枸橼酸，鉴别诊断时必须注意，后者尿中还可检出甲基丙二酸。图2-3 对照组与丙酸血症组的提取离子色谱图表2-3 筛查患者样品中的MMA、3OH-PA和C4DC，假阳性的样品，C4DC-阳性斑点和对照样品注：ND：不可检测；WR：可接受的区间内第四节 质谱技术在异戊酸血症诊断中的应用一、异戊酸血症简介
异戊酸血症（isovaleric acidemia，IVA）是由于异戊酰辅酶A脱氢酶（isovaleryl-CoAdehydrogenase，IVD）先天性缺陷所致的一种罕见的遗传代谢病，属于有机酸血症的一种，系常染色体隐性遗传病，是由于亮氨酸分解代谢不足导致异戊酰基-辅酶（CoA）脱氢酶缺乏，从而引起自由异戊酸、3-羟基异戊酸、N异戊酰基甘氨酸、异戊酰基肉毒碱（Isovaleryl carnitine，C5）在体内的积累。与此缺陷相关的各种临床症状包括进食障碍、呼吸急促、呕吐、精神萎靡、嗜睡、昏迷和脱水。这种缺陷的主要特征是异戊酰基甘氨酸的尿排泄。IVA发病时亮氨酸分解过程中的分解代谢产物异戊酰辅酶A的正常代谢途径被阻断，导致旁路代谢生成的异戊酰甘氨酸和3-羟异戊酸在体内聚集，侵害患儿的神经与造血系统，导致发育迟缓、运动失调、昏迷甚至死亡。二、目前临床诊断异戊酸血症的方法
IVA患者中超过半数是新生儿期发生急性脑病，另外半数表现为婴儿和儿童期反复呕吐、嗜睡或昏迷及智力发育落后，根据这些临床症状可初步对该疾病进行诊断。近年来，随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的发展，对血酰基肉碱谱和尿有机酸的监测变得更加方便。三、质谱技术在异戊酸血症诊断中的应用
近年来，串联质谱分析技术在诊断该疾病的干血滤纸片中氨基酸和酰基肉碱水平检测分析过程中能够提供重要的技术支持，我国在2002年开始利用MS/MS方法对新生儿代谢紊乱疾病进行筛查和诊断，并建立了可靠的方法。
实例：
使用串联质谱方法筛选临床患有先天性新陈代谢障碍的患者
样品来源：
样品来自于13例先天性代谢障碍病患者，平均年龄为1.1岁（1天～11岁）。
实验仪器：
API2000串联质谱仪，购自Applied Biosystems；高效液相色谱仪为Agilent1100。
质谱条件：
对于氨基酸，中性丢失扫描用m/z 102，使用的扫描范围为m/z 210～502，产物离子用m/z 85进行前体扫描；对甘氨酸、鸟氨酸、精氨酸和瓜氨酸进行多反应检测。
样品前处理方法：（1）GC-MS分析方法：
4～7天目标疾病的新生儿筛查后采集尿液标本、血液标本，采用Guthrie法处理。液体尿液或GC-MS测定的滤纸尿液样品的准备程序同本章第二节中的样品处理方法。（2）LC-MS分析方法：
样品制备是将每个干血滤纸样品放到3.2mm直径的穿孔圆盘中并放置在96孔滤板中，每孔加100μl含有内标的甲醇，室温20分钟后离心，然后将液体加到96孔聚丙烯板中，50℃氮气流下吹干。随后每孔加60μl丁烷氯化氢，用聚四氟乙烯膜覆盖住板子，65℃孵育15分钟。然后每孔中注入100μl乙腈-水（4∶1，V/V），准备进样。
数据处理：
用ChemoView 1.2软件依据内标指定值自动分析氨基酸和酰基肉毒碱水平。
结果分析：
质谱图以及质谱检测的特征离子分别如图2-4和表2-4所示。
图2-5为使用L-肉碱和蛋白质控制饮食治疗前和治疗中的患异戊酸血症的新生儿血液斑点中的短或中长链的酰基肉碱的测定情况。注意乙酰肉碱（C2）浓度的正常值和异戊酰2-甲基丁酰肉毒碱（C5）、稳定同位素标记内标（IS）浓度的变化，以及正常对照组的血液斑点（母离子扫描为m/z 99）。图2-4 患儿的血串联质谱图谱+a表2-4 氨基酸结合物和其特有的ESI-MS-MS子离子片段以及M质量a+注：ESI-MS-MS子离子片段和M质量用于识别IVA患者的尿样异戊酰和乙酰氨基b酸偶联物；原子量，原子质量单位图2-5 异戊酸血症患儿血样中的酰基肉碱
根据以往的研究可知异戊酸血症患者的尿液中会产生大量的N-异戊酰基组氨酸、赖氨酸、色氨酸以及乙酰色氨酸，这些氨基酸的结合可能造成显著的异戊酸血症的临床症状。血液串联质谱分析显示，C5酰基肉碱水平明显升高，不伴有其他酰基肉碱或氨基酸异常。其父母血液中的氨基酸和酰基肉碱谱未见明显异常。患儿的尿液气相色谱-质谱有机酸分析显示异戊酰甘氨酸明显升高。结合患儿的临床症状和实验室检查，以及MS-MS和GC-MS结果，临床诊断为异戊酸血症（表2-5）。表2-5 国内报道的13例异戊酸血症患者的特征第五节 质谱技术在生物素酶缺乏症诊断中的应用一、生物素酶缺乏症简介
生物素酶缺乏症是先天性生物素代谢异常的常见疾病，该疾病常表现为严重的神经和皮肤损害，可在各个年龄段发病，其死亡率、致残率极高，生物素补充治疗疗效明显。早期发现、合理治疗是挽救患儿、改善预后的关键。本症的发病情况目前国内报道甚少，自1983年首例生物素酶缺乏症被报道以来，此疾病逐渐受到世界各国的重视，为了使该疾病能够在出现症状前得到诊断，一些先进国家将此症列为新生儿筛查项目之一。本病的遗传方式为常染色体隐性遗传，致病基因为BTD基因。BTD基因上有4个外显子，位于3p25。生物素酶缺乏症可由全羧酶合成酶（holocarboxylase synthetase，HCS）、生物素基酶及外源性生物素酶缺乏所致，其中全羧酶合成酶及生物素基酶缺乏是导致多羧酶缺乏的主要原因，也是生物素酶缺乏的内源性因素。二、目前临床诊断生物素酶缺乏症的方法
目前，该疾病的诊断主要依靠临床症状、化学分析手段监测血液酯酰肉碱谱、尿有机酸等。经气相色谱-质谱联用分析、尿有机酸测定及干燥滤纸血片生物素酶活性分析（比色法）确诊。同时通过血尿常规检查、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、丙酮酸、肝肾功能、心肌酶谱、氨基酸分析、脑或脊髓CT、MRI等辅助检查了解病情。三、质谱技术在生物素酶缺乏症诊断中的应用
对尿液中有机酸的分析是生物素酶缺乏症筛查与诊断的重要方法，典型患儿尿中可见大量丙酸、丙酮酸、乳酸、β-甲基巴豆酰甘氨酸、巴豆酰甘氨酸、β-羟基异戊酸、丙氨酸等异常代谢物。
实例：
串联质谱技术在生物素酶缺乏症鉴别诊断中的应用
样品来源：
临床疑似遗传性代谢病儿童78例，来自于全国80余家医院，年龄为1天～18岁，平均年龄为5.3岁。
实验仪器：
采用岛津GC/MS2QP2010分析仪、安捷伦1290液相色谱系统和
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