作者：宓捷波、许泓 主编
出版社：化学工业出版社
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液相色谱与液质联用技术及应用试读：
前言
为了出版一套服务于分析检验行业和企业的优质系列丛书，化学工业出版社联合全国部分高等院校、职业院校，进出口检验检疫局及国内外著名仪器公司的专家，于2016年12月在北京召开“分析与检验技术类专业丛书编写研讨会”，对目前国内分析检测行业的现状和发展趋向进行了充分的研讨，确定编写一套适应目前行业发展情况，具有指导意义的分析检测丛书，并明确了本系列丛书的编写内容和编写方案。丛书编写委员会以全国石油和化工职业教育教学指导委员会高职工业分析与环境类专业委员会副主任王炳强教授为主任，天津大学范国樑教授、班睿教授，天津科技大学杨志岩教授，天津出入境检验检疫局许泓研究员，南京科技职业学院王建梅副教授，江西省化学工业学校曾莉教授为专家组成员。参加研讨会的沃特世（Waters）科技公司北区应用部经理仇雯丽、安捷伦（Agilent Technologies）科技公司应用市场部经理祝立群、岛津（Excellence in Sicence）仪器设备公司市场部经理梁志莹、美国热电（Thermo Fisher）公司市场部经理贾伟和项目博士也在研讨会上充分发表了意见并提出很多建设性方案设想。相信本系列丛书的出版能有助于提高我国分析检测技术人员的创业创新意识，更好地服务于现代化企业和科学研究机构，并为从事分析检测工作人员服务。为了更好地指导一线化验员和分析检测人员进行常规的工作，丛书分为六个板块单独成册，即：化验员实用操作指南、化学分析与电化学分析技术及应用、原子光谱分析技术及应用、分子光谱分析技术及应用、气相色谱与气质联用技术及应用、液相色谱与液质联用技术及应用。主持编写工作的专家都是分析检测第一线工作的博士、高级技术人员和专家学者。本套丛书力求突出如下特色：1.注重内容的先进性和实用性。本书编写按照理论联系实际、注重实用的原则。在内容选用上，主要是依据有关国家标准所收载的内容及新规定而编写，并适当反映现阶段国内外新技术概况，以满足读者从事质量监控、面向国际市场的要求。2.注重理论与实践紧密结合。书中各章节理论知识都配有具体案例分析。这些案例都是作者长期实验的结晶和工作的总结，方便读者通过案例拓展相关的检测工作。实用案例中有很多是近年来形成的分析检验的行业案例，尚未形成国家标准，以满足在分析检测重要岗位上分析研究的特殊需要。3.注重实践操作指导。努力使本书适应高级技术应用型人才的使用，在一些问题的讨论上力求有一定的深度。在一些应用上给出一定的讨论空间，对层次比较高的读者可以查阅相关专著和资料去解决。4.注重方便于读者阅读和查找有关资料。本书内容编排上，把有关案例放在相关的章节内，使基本理论和案例训练衔接更为紧密，便于读者查找并使用。本套丛书在编写过程中，沃特世、安捷伦、岛津、美国热电、美瑞泰克科技等公司提供了大量案例供编者参考，编者还参考了有关专著、国标、图书、论文等资料，在此向有关专家、老师、作者致以衷心的感谢。本套丛书编写过程中，得到中国化工教育协会和全国石油和化工职业教育教学指导委员会的指导和帮助；得到化学工业出版社的热情支持和业务指导，在此表示深深的谢意！由于时间和水平所限，书中缺陷在所难免，欢迎广大读者提出宝贵意见。编委会2018年3月前言商品化的高效液相色谱仪问世已有半个多世纪，经过不断完善，功能越来越多。现在的商品机，其输液泵的性能、检测器的类型、色谱柱的填料种类和规格较之早期仪器都有极大提升，因此分离效果越来越好，分析速度越来越快，检测的化合物种类越来越多，覆盖的领域越来越广，成为化学分析检测不可缺少的仪器。20世纪末，常压电离接口技术解决了液相色谱-质谱联用的难题，使商品化液相色谱-质谱联用仪进入成熟期，成为真正能满足实用分析检测的仪器，其应用技术亦有了长足进步。液相色谱-质谱/质谱联用仪及技术以其独有的优势，成为21世纪以来发展和普及最快的化学分析检测仪器及技术。由于液相色谱-质谱/质谱联用仪定性准确，检测灵敏度高，定量有较宽的线性范围，使其应用领域更加广泛，已成为现代分析检测实验室不可或缺的仪器，是本书介绍的重点。本书为分析检测类图书，书中简单介绍了液相色谱仪和液相色谱-质谱/质谱联用仪的技术原理、主要组成部件、功能、参数指标等。重点介绍两种仪器主要应用领域中的典型实例，以及采用该技术做分析检测时遇到的一些常见问题的解决方法。涉及色谱和质谱的基础理论知识部分，请参阅丛书的“气相色谱与气质联用技术及应用”。本书在编写过程中主要参考了有关专著、国家标准和行业标准、图书、论文等资料，并结合我们实验室日常检测实际工作，描述了部分标准方法操作的关键控制点。安捷伦、SCIEX、岛津、赛默飞世尔科技、沃特世等公司的技术专家还为本书提供了部分应用方法实例。在此向有关老师、专家、论文作者、实验室人员致以衷心的感谢。由于时间和水平所限，书中存在缺陷在所难免，欢迎广大读者提出宝贵意见。编者2018年5月第一章 液相色谱技术及应用第一节 概述一、液相色谱发展简史从20世纪初色谱法发明以来，经历了整整一个世纪的发展，到今天液相色谱法已经成为最重要的分离分析方法，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、食品、环境保护乃至空间探索等。
在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早发明的。1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）将吸附原理应用于植物色素的分离实验，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为色谱法（chromatography），这个词是由希腊语中“色”的写法chroma和“书写”（graphein）这两个词根组成的，派生词有chromatograph（色谱仪）、chromatogram（色谱图）、chromatographer（色谱工作者）等。这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱是对这个单词的意译。
1931年德国柏林威廉皇帝研究所的库恩将茨维特的方法应用于叶红素和叶黄素的研究，其研究成果获得了科学界的广泛承认，色谱法正式进入学术界。之后，在有色物质的分离中，以氧化铝为固定相的吸附色谱法受到众多研究者的青睐。
1938年马丁和辛格将水吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸，成为分配色谱应用的第一个成果。在获得成功之后，马丁和辛格的方法被广泛应用于各种有机物的分离。1943年马丁和辛格又发明了在蒸汽饱和环境下进行的纸色谱法。
1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的设想，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸，完成了最早的气相色谱实验。气相色谱法在这一时期发展迅速，不同特性的检测器不断涌现，同时，在色谱学理论中有着重要地位的塔板理论、范德姆特（Van Deemter）方程和保留时间、保留指数、峰宽等概念也逐渐成形。尽管这一时期，液相色谱发展仍十分缓慢，但气相色谱的检测器技术和色谱理论的发展为后期液相色谱的发展奠定了基础。
自1906年茨维特分离植物色素至1960年代末的液相色谱技术又称为经典液相色谱技术，这一时期的液相色谱通常用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，此方法由于使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，所以色谱分离效果差、时间长。
1969年，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了液相色谱的新时代。之后，小粒径全多孔球形硅胶和稳定性键合固定相的出现，大大提高了色谱柱的塔板数，同时借助往复式双柱塞恒流泵以高压驱动流动相克服小粒径填料引起的高阻力，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成，由于这种液相色谱技术具有高压、高速、高分离度的特征，因此被称作高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）。
1971年，科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。现代意义的HPLC发展也自此进入高速推进的快车道。作为一种有效的分离检测手段，HPLC在化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、检验检疫和法检等领域都展现出独特的优势。此外，HPLC也直接推动了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1973年，第一届国际液相色谱会议在瑞士的因特拉肯举行，这是一次HPLC研究者的盛会，HPLC的研究及展示在会议中获得了大量学者的关注，其中几乎50%以上的论文将讨论的重点集中在色谱柱的问题上，其余论文则关注了HPLC的检测器和实际应用。
到20世纪80年代中期，计算机模拟预测高效分离结果与实际实验相结合，使计算机逐渐承担了色谱分析结果的繁重数学计算工作。期间，科达（Ko dak）实验室中已经能够利用对聚合度为反相键合色谱柱分离900多种多聚取代磺酸芳香高级性化合物；雷格里尔、哈恩和汉卡克以及他们的同事建立了对映体（手性异构体）和大生物分子如蛋白质的HPLC方法；超临界流体色谱法（SFC）、毛细管电泳（LZE）、制备色谱法（PC）等也逐渐开始应用。
近年来，HPLC的色谱柱改进和完善进程更是迅速，亚2μm粒径、各种修饰已成为当前应用的热点；超高压输送泵的出现则不仅缩短了分离时间，而且将高效液相色谱的有效塔板数提高了数百倍，使分离效率飞速提高。
经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。现在，HPLC几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样，在目前已知的有机化合物中，若事先不进行化学改性，只有20%的化合物用气相色谱可以得到较好的分离，而80%的有机化合物则需HPLC分析。在短短的30多年里，HPLC从初步成形发展成为成熟而广泛应用的分析方法。目前，HPLC在化学、生物医药、食品等领域的分离和分析中已是不可或缺的重要技术。二、液相色谱基本原理（一）概述
色谱法的分离以化合物在流动相与固定相之间的相互作用为基础，当溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。如果色谱分离过程中使用的流动相是液体，则称为液相色谱。高效液相色谱则指以泵高压驱动流动相，使用小粒径多孔硅胶或稳定键合固定相的液相色谱。
由检测器将分离情况转换成电信号进行记录，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。当待测组分流出色谱柱时，检测器就可检测到相应组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，称为色谱峰，理想的色谱峰流出曲线应该是符合正态分布的曲线（见图1-1）。图1-1 典型色谱流出曲线
为了解释色谱流出曲线的形状、探究实际色谱区带扩散的影响因素和从理论上指导色谱分离和定量结果，人们从热力学、动力学等方面进行了大量的研究，形成了塔板、速率、平衡等经典理论，为评价表征柱效、定量关联色谱参数与柱效以及探究各种因素对色谱流出曲线的影响奠定了研究基础。（二）基本概念和术语
高效液相色谱的分离原理、溶质在固定相中保留、扩散等概念基本源自气相色谱法，所以，适用于气相色谱的一些概念、术语及分离的基本关系式，往往也适用于高效液相色谱法。高效液相色谱法中的一些基本概念和术语如下：
① 色谱图（chromatogram） 样品流经色谱柱和检测器所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）。
② 基线（base line） 经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线，一般应平行于时间轴。
③ 噪声（noise） 基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
④ 漂移（drift） 基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⑤ 色谱峰（peak） 组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和拖尾峰（tailing peak）。
⑥ 标准偏差（standard deviation，σ） 正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小，极点浓度高，峰形瘦，柱效高；反之，σ大，峰形胖，柱效低。
⑦ 峰底 基线上峰的起点至终点的距离。
⑧ 峰高（peak height，h） 峰的最高点至峰底的距离。
⑨ 峰宽（peak width，W） 峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
⑩ 半峰宽（peak width at half-height，W） 峰高一半处的峰h/2宽。峰面积（peak area，A） 峰与峰底所包围的面积。死时间（dead time，t） 不保留组分的保留时间，即流动相（溶0剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积（dead volume，V） 由进样器进样口到检测器流动池未0被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，V）、柱出口管路体积、检m测器流动池体积。其中只有V参与色谱平衡过程，其他3部分只起峰m扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。保留时间（retention time，t） 从进样开始到某组分在柱后出现R浓度极大值的时间。保留体积（retention volume，V） 从进样开始到某组分在柱后R出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。调整保留时间（adjusted retention time， 扣除死时间后的保留时间，也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，只决定于组分的性质，因此，（或t）可用于定性。R调整保留体积（adjusted retention volume，） 扣除死体积后的保留体积。理论塔板数（theoretical plate number，N） 用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效），取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。若用调整保留时间（）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N或N）。有效eff理论塔板高度（theoretical plate height，H） 每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。分配系数（distribution coefficient，K） 在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。容量因子（capacity factor，k） 化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。选择性因子（selectivity factor，α） 相邻两组分的分配系数或容量因子之比。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。分离度（resolution，R） 相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。（三）塔板理论
1.塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：
① 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
② 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
③ 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。
④ 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。
2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）
根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述：
由色谱流出曲线方程可知：当t=t时，浓度c有极大值c。cRmaxmax就是色谱峰的峰高。上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量c（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定0
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