作者：方尚玲 等 著
出版社：化学工业出版社
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酿酒功能菌的筛选与应用试读：
前言
酿酒的研究，离不开对酿酒原料、工艺和设备的研究，更离不开对酿酒功能微生物的研究。微生物虽然是只能用显微镜才能看见的微小生物，但正是这些微小生命的大量繁殖和代谢产物，提供了丰富的酶源，将淀粉、糖、蛋白质等成分变成了酒精、氨基酸及醇、醛、酸、酯等香味物质，可以说，微生物在酿酒过程中起到至关重要的作用。不同的菌种、不同的培养条件和工艺，产生不同的结果，直接影响酿酒的质量和产量，酿酒工业能有今天的成绩，是与对微生物的认识与应用分不开的。值得自豪的是，中国几千年的酿酒历史，给我们留下了极其丰富的优良的菌种和制曲经验，为进一步研究奠定了基础。《酿酒功能菌的筛选与应用》一书涵盖了近些年来酿酒微生物研究与应用成果，包括酿酒功能菌的筛选、发酵条件的优化、功能菌之间的复配组合以及应用研究，进而以微生物生态学的观点为出发点，发掘新的微生物资源，发现了放线菌对己酸菌产己酸的促进作用，放线菌所产黑色素是促己酸菌产己酸的促进因子。本书具有一定的学术价值和较好的实用价值，对酿酒工业有一定的参考价值。
本书在编写过程中，得到湖北工业大学生物工程与食品学院领导的关心和支持，酿酒团队负责人陈茂彬教授的指导，汪江波教授、镇达副教授以及团队所有成员的大力相助，研究生管健为本书的资料收集、整理和排版付出了辛勤的劳动，在此一并表示诚挚的谢意！
由于编者水平有限，加上时间紧迫，如有疏漏和不当之处，请各位专家和广大读者批评指正。编者于湖北工业大学2018年5月第一章 引言第一节 功能菌的功能特性
白酒是中国传统发酵食品，历史悠久，一直受到人们的欢迎。中国传统白酒，是以含淀粉质的谷物为原材料，以曲为糖化剂，采用固态发酵、半固态发酵、液态发酵三种发酵方法，经过蒸馏、储藏、勾［1］调等步骤而得到的含酒精的饮料。由于酿酒材料、酒曲类型和生产技术以及自然环境等因素的差异性，使得酿造而成的白酒的风格也各不相同。
白酒功能菌指的是在白酒酿造过程中，促进白酒发酵或对白酒风味物质形成有益的微生物。在白酒的酿造过程中，要形成不同风格的白酒，主要是生香，白酒香味成分的差异，产生了不同香型的白酒［2］
。白酒发酵酒醅中栖息着种类繁多、含量丰富的有益微生物菌，因此，筛选出具有优良性状的功能菌株，了解功能菌的生物学特性，明确功能菌的分类、地位，对于探索不同香型白酒的酿造机理和进行生产技术革新具有重要的理论与现实意义。本文主要从功能特性和功能菌株的应用两方面对白酒功能菌进行综述，旨在为功能菌的进一步研究和使用提供参考。
随着对白酒微生态系统研究的不断深入，酿酒功能菌在白酒生产中的作用日益明显。酵母菌能够有效提高白酒发酵的性能，并提高原酒中酸和酯的含量；霉菌可以将酿酒原料进行分解，并产生较高活性的糖化酶及蛋白酶；芽孢杆菌则能够为绵柔型调味酒提供其特定的香［3］气成分。这些功能菌的协同生长，能促进白酒风味成分的生成。要想提高酒质，必然要对功能菌株的功能特性和发酵条件进行研究，提升糖化力、液化力、发酵力及产酯能力，增加发酵产香中间体的底物含量，同时改善发酵过程中的微生物的微生态环境，使得功能菌株之间相互协调。白酒发酵的功能菌主要是酵母、霉菌、细菌和放线菌。（一）酵母的功能特性
酵母是产酒与生香的关键功能菌，影响白酒的出酒率及香味成分，是白酒酿造中的主要功能菌之一。根据酵母在发酵过程中的作用可分为两大类酵母：主产酒精的酿酒酵母和发酵效率较低但对风味亦有重要贡献的非酿酒酵母，它们能促进酒精及香气物质的生成。李红［4］等从茅台酒厂酿酒车间分离选育出1株高产酒精酵母，其发酵力、淀粉出酒率分别为18.0g/100g、29.6%，适合应用于淀粉质原料的酿［5］酒。边名鸿等从泸州酒曲中分离得到1株优良产酒酵母Y-18，同时，通过纯种酵母与根霉进行复配实验，结果显示，根霉曲与酵母曲的比例为1∶3.6的条件下效果最佳，可作为利用该菌株生产小曲的参考依据。而且从发酵原料和自然环境中筛选培育高产酒精的酵母，既经济又方便，这些酵母菌不断被人工驯化，有较好的产酒精和耐酒精［6］的能力以及稳定的遗传特性。
非酿酒酵母主要产香、产酯，可生成多种醇类、醛类和酯类等香［7］味物质，对白酒香味的形成有重要贡献。廖建民在泸州老窖酒曲中筛选出25株酵母菌，通过对这些酵母菌进行形态观察、生理生化特性的检测，从中优选出酵母S2.10，其特性为酯香浓郁，产酸力较［8］强，适合浓香型白酒的酿造要求。朱莉莉等从浓香型大曲中筛选出了1株复合功能性突出的菌株J17，这株菌发酵后能产生较为丰富的风味物质，比如乙酸乙酯、苯乙醇和愈创木酚等，这些物质在浓香型白酒的香味成分中占有重要位置。［9］
除了产酯产香功能外，有的酵母还具有产酶特性。庾昌文和［10］王晓丹等分别从清香型小曲酒醅和茅台大曲中各分离了1株扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），该酵母能够生成淀粉液化酶和糖化酶，被认为是产生淀粉分解酶类最好的子囊酵母菌之一，同时也具有产酯能力。（二）霉菌的功能特性
霉菌具有糖化力、液化力和蛋白分解力，还可以产生多种有机酸。［11］班世栋等从酱香大曲中筛选出了2株功能性霉菌，具有较高的糖［12］化酶、液化酶和蛋白酶活力。王晓丹等从浓香型大曲中分离出了1株具有较高酯化酶活力的菌株，经鉴定为红曲属的紫色红曲霉。［13］吕梅等在中高温大曲中筛选出了1株高产酯酶菌株HSM，经过鉴定是多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）。除了产酶外，近年来也有［14］研究表明霉菌还可以产香。罗惠波等以15株霉菌为出发菌株，筛选得到1株具有较强产香能力的霉菌Njsys45，其总酯含量是0.14%，［15］可提升小曲酒质。王晓丹从酱香曲中筛选了1株阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus），用固相微萃取-气质联用技术（SPME-GC-MS）对其发酵香味物质进行分析，发现该菌的发酵产物具有浓郁的花香和果蔬香，挥发产物以高级醇、酮、呋喃类酱香物质为主。有研［16］究表明，根霉一般参与一些低沸点物质的合成，曲霉可以促进某些酯类的合成，木霉可以降解淀粉、纤维素，青霉对曲质也有一定的影响。（三）细菌的功能特性
细菌为酿酒产香提供主要动力，在白酒酿造中存在多种细菌，且［17］大多数为芽孢杆菌。曹敬华对细菌的产香机制进行了探讨，认为细菌在生长代谢过程中分泌的某种酶类可以促进美拉德反应的发［18］生，从而利于产香。袁庆云从茅台大曲中分离得到1株地衣芽孢杆菌，进行纯种固态发酵后用GC-MS检测，发现该菌能代谢产生70多种茅台酒风味物质和风味前体物质。有的细菌具有产淀粉酶能力。［19］钟小娟等在酒鬼酒制曲间筛选出了4株产淀粉酶活力较高的芽孢［20］杆菌。有的细菌还能产蛋白酶。王俊在郎酒大曲中筛选出了2株枯草芽孢杆菌，蛋白酶活力最高分别可达到5022.57U/g和4359.25U/g。（四）放线菌的功能特性
放线菌对白酒的风味也有一定的影响，相较于上述三类微生物，［21］暂时还没有得到足够的重视。有研究表明，放线菌可以调控产酱香的芽孢杆菌，进而影响产香菌的生长和产香。放线菌还可产生己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和糠醛等对浓香型白酒风味有重要作用［22］［23］的挥发性物质。郭威以Streptomyces avicenniae GW01（白骨壤链霉菌）为出发菌株从放线菌的产酶特征研究，对放线菌促己酸菌产己酸的机理进行探究，证实了白酒酿造过程中某些放线菌对己酸菌产己酸有促进作用；并且通过产酸发酵试验发现，放线菌所产黑色素可促进己酸菌产己酸，这为己酸菌的应用提供了新的方［24］向。第二节 功能菌在白酒中的应用
目前对功能菌的研究主要是为了弥补白酒风味的不足，传统方法生产的大曲易受自然环境因素影响，造成用曲量大、出酒率低等。因此，通过白酒功能菌的应用，提高曲的质量，丰富白酒发酵过程中的微生态环境，进而增加各香型白酒的骨架香味成分。近年来，随着对白酒功能菌研究的不断深入，从大曲或者窖泥中分离筛选出上千种微生物菌种，许多厂家开始将有益功能菌应用于传统白酒的生产中，以提高酒醅中微生物的种类和数量，提升白酒的质量，并取得了一定的
［25］成果。（一）功能菌在酱香型白酒中的应用
对酱香型白酒功能菌的研究不仅能揭示酱香风味的形成机理，也有助于优化酿酒工艺，提升白酒品质。功能菌在酱香型白酒中的应用［26］大多集中在强化制曲过程。例如三九龙滨酒厂从茅台酒酿造微生物中筛选出了6株产酱香细菌制细菌曲，然后再强化大曲，从而提高了大曲的质量，添加细菌曲制作的强化高温曲的质量要比不添加细菌曲的高温曲好。同时，添加细菌曲，既利用功能菌产酱香，又可以促进堆积过程中的升温，并且可以使发酵周期延长，有助于产酱香物［27］质的积累，更易产酱香。马荣山从凤城老窖酒厂的麸曲酱香白酒酒醅中筛选菌种，用平板分离到了7株酵母。用各酵母菌分别制曲，然后测定其发酵力，得到5株发酵力较强的酵母，并通过正交试验确定了酱香白酒的最佳生产工艺。实验表明，在发酵时间为21天、发酵温度为20℃、料曲比为1.1∶1、接种量为13%的条件下，酒质最好。
功能菌除了强化大曲外，还可以制备成制剂，与大曲混合使用。［28］武陵酒业有限公司把含有多种活性功能微生物的增香菌剂作为种曲，将其与高温大曲一起用于酱香型白酒的生产，以降低高温大曲的用量。研究结果表明，加入增香菌剂可以降低高温大曲的用量，增加酒中的香味成分，对酒质和出酒率有一定的提高。［29］
堆积是酱香型白酒微生物的一个富集过程。印璇分别比较了功能细菌直接入窖和堆积之后入窖两种强化方式对酒质的影响，结果显示，堆积后入窖的强化实验中四甲基吡嗪含量提高了12%，直接入窖实验使四甲基吡嗪含量提高了4%，两种方法酸酯含量均有不同程度的提高。所以功能菌的加入时机与加入方式对白酒微生物的代谢同样有一定的影响。（二）功能菌在浓香型白酒中的应用
己酸菌是一种产酸菌，对浓香型白酒的酿造非常重要，己酸菌代谢产生己酸，可与酵母发酵产生的酒精反应生成己酸乙酯，己酸乙酯［30］是浓香型白酒的主体香味物质。湖北枝江酒业从老窖泥中分离出己酸菌，扩大培养后添加适当比例的乙酸钠、母糟、老窖泥等物质，制备成功能菌液，使窖泥中的微生物与新投入的己酸菌共同生长，不但能大幅增加酒体中己酸乙酯的含量，也能丰富其他的微量成分。罗［31］小云等将己酸菌和老窖泥复合微生物按照1∶1的比例复配制得窖泥功能菌液，从而使窖泥功能菌适应窖内复杂的发酵环境，以达到［32］强化发酵体系中窖泥功能菌含量的目的。陈翔等将己酸菌与酵母菌、细菌、霉菌进行混合培养，制备成混合己酸菌液，并应用于窖泥制作中，出酒率达35%，优酒率达15%，使得以往改造后的窖池第一排无优级酒的现象得到解决。
对浓香型白酒来说，窖泥质量的好坏直接影响酒质的好坏，但人工窖泥在使用2～3年以后，往往会出现一定程度的退化和老化现［33］象。四川丰谷酒业认为人工窖泥易退化的原因是缺乏调节窖泥pH作用的微生物，综合考虑窖泥复合功能菌液对退化窖泥的影响，采用功能菌液来养护退化窖泥、提高窖泥pH、增强产己酸能力，基［34］酒品质得到明显的提高，优品酒率高达32.8%。姚万春等从窖泥的配方入手，选择合适的基础泥，模拟老窖泥中有益微生物的生长环境，并添加适量的辅料与营养物质，以便窖泥功能菌能更好地生长、繁殖和代谢，保证有益微生物具有良好的生长和繁殖环境。
功能菌的复配使用还可以丰富窖池中的微生态体系。泸州老窖酒［35］厂从200个酒曲中筛选出了2株糖化功能菌A2-3和LZ-24，1株发酵功能菌S2.10以及1株生香功能菌R-3，将其按照适当的比例复配成功能菌，并通过强化制曲来提高其酶活力，丰富微生物的数量。用该曲酿酒酒质也得到了提高，总酸、总酯含量分别提高了24%和6%，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯含量也分别提高了16%、46%、43%。［36］江苏洋河酒厂筛选了8株霉菌、2株酵母和2株细菌，通过强化制曲、人工老窖、功能性菌液、多微生物功能曲等方式应用到白酒生产中，既保留了传统酿酒工艺，又有所创新，可以提高白酒品质，窖池出酒的酒体骨架成分和感官品评也表现良好。［37］
有研究表明，梭状芽孢杆菌对浓香型白酒的风味也有贡献，其主要的代谢物质是己酸、丁酸和氢气，而且己酸菌和甲烷菌的共生会促使己酸的生成，该研究为人工窖泥的改造和复合功能菌的使用提供了重要的指导方向。（三）功能菌在清香型白酒中的应用
清香型白酒的研究较浓香型、酱香型白酒来说较少，主要集中在［38］高产酯菌的筛选与应用。劲牌有限公司从酒曲中筛选出了4株高产乙酸乙酯酵母，将其中3株扩大培养后制成酵母麸曲，并应用于中试车间发酵，发现添加功能酵母并不影响出酒率，Y29和Y42两株酵母的乙酸乙酯含量比对照组分别提高了99.4%和51.1%，正丙醇含量［39］分别下降了44.2%和42.7%。马红霞通过基因重组构建高产乙酸酯酿酒酵母MY15，并应用于清香型大曲白酒的生产中，结果显示，重组菌株和亲本菌株相比，具有高产乙酸酯低产高级醇的特点。
在清香型白酒的生产过程中，乙乳比例失调也是一个普遍存在的［40］问题。牛栏山酒厂从清香型大曲中筛选出1株可降解乳酸的枯草芽孢杆菌，通过中试实验验证，其可有效降低白酒中乳酸乙酯的含量，同时少量提升乙酸乙酯的含量，解决了乙乳比例失调的技术难题。牛［41］栏山酒厂还从清香型大曲和酒醅中分离筛选出1株高糖化酶活力米根霉，将其制成麸曲，保证原大曲酒的工艺不变，并且适当添加米根霉麸曲辅助发酵，大曲与麸曲复合使用、取长补短，提高了出酒率，也能达到增乙降乳的目的。（四）功能菌在其他香型白酒中的应用
白酒香型除了浓、酱、清三种主流香型以外，还有兼香、凤香、豉香、特香等其他香型。由于这些香型属于小众香型，故研究也相对较少。对于功能菌的使用，大多也是为了促进产酯、提高出酒率。表1-1简要介绍了近些年来功能菌对白酒品质的提升作用，为功能菌定向提升白酒风味提供了理论支持。表1-1 功能菌在白酒生产中的应用
功能菌对白酒品质的提升，主要是通过提高微生物在发酵过程中的浓度来实现的，虽然取得了一定的成效，但是相对国外酿造酒来说，尚存在着对发酵机理认识的不清晰，局限于功能微生物的筛选应用及酒体风味物质成分的定量分析等方面，缺乏对发酵过程中重要微生物间相互作用的研究及微生物在发酵过程中结构变化的解析，从而不能从根本上掌握白酒发酵过程。因此，认识白酒发酵本质，进而提高白酒品质仍需要深入研究。
目前白酒功能菌的研究大部分是对那些影响白酒生产的模式菌株的分离、筛选和鉴定，也有实验室尝试用分子手段，例如原生质体融［51，52］合、定向筛选、基因工程等方法构造功能菌。但对于白酒风味物质的形成与微生物关系等方面的研究不够深入，多数也仅仅是在工艺上的改进或用纯种的微生物对发酵过程进行强化，对各种风味微生物之间的相互作用则了解甚少。
研究复合功能菌，有利于扩大菌种的应用范围，既可用于单一功能强化大曲，又可以应用于多功能性大曲或制作成制剂，与曲粉混合发酵。对于功能菌株的研究，要善于挖掘微生物的各项特点和最佳生长代谢条件；还需要尽可能多地筛选出功能微生物，研究它们的糖化、液化、产酒、产香等特性，利用它们之间的协调性，将不同种类的功能性微生物进行搭配、优化，应用于不同香型的白酒。特别是现在各酒厂正在快速地进行机械化改造，用复合功能菌来弥补机械化过程中的发酵微生态体系显得尤为重要。参考文献
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产酯酵母又称生香酵母，不是酵母分类学上的名词，是指可生成较多量酯类物质的酵母的通称，分属于汉逊酵母属、产朊酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等。产酯酵母，大多是一些野生酵母，它们在自然界中分布较广，在酿造工业的原料、制造工序以及制成品中均有不同程度的出现。在国外一般将其视作有害杂菌，有益的菌种比较稀少，但它们在我国白酒中所占的地位却完全相反，是产［1］香的主要菌种之一。
产酯酵母在发酵时会产生多种物质，主要有醇类、酯类、酸类等，还会产生少量烷烃类、胺类、芳香烃类、酮类、醛类等物质，这些物质的含量各异，从而构成了各酵母菌的不同发酵香气。产酯酵母对乙醇的亲和力很强，以乙醇作碳源能发育得很好，而且又有较强的氧化特性。乙醇能增进产酯酵母的呼吸作用。与酯发酵之间存在特殊关联。产酯酵母具有一定的酒精发酵力，又具备乙酸发酵的能力。酯发酵组成中的羰基来自乙醇的氧化生成物，即产酯酵母必须具有氧化乙醇的能力。（一）产酯酵母产乙酸乙酯的代谢机理
目前关于产酯酵母的代谢机理相关报道不多。普遍认为，乙酸乙酯是在酵母细胞内合成的，而不是在培养基中由酯化作用生成的［2］
。所以乙酸乙酯是一种胞内产物，酵母菌健壮与否对酯的生成有着密切的关系。通过诱变异常汉逊酵母得到其呼吸缺陷型菌株，然后与出发菌株对比发酵产酯，比较其产酯量的变化，推断乙酸乙酯是呼吸代谢产物，是作为异常汉逊酵母特有的一种储能方式而存在的。其代谢途径如下：
可以认为，乙酸乙酯是作为异常汉逊酵母特有的一种储能方式而［3］存在的。阮文权的研究表明，氧气在酯类代谢中起了很重要的作［3］用。（二）产酯酵母的产酯条件
产酯酵母代谢产酯与很多因素有关，包括产酯培养基、温度、pH、氧气、时间、酒精及有机酸类等多种因素。多位学者对产酯酵［4］［5］［6］母的产酯条件进行过研究，如吴桂珍、施安辉、吴思方等，其研究结果大致相同，最佳的产酯条件如下。
产酯酵母通常在19～30℃的温度范围内均能产酯，但最适产酯温度为25～30℃。培养温度升至37℃以上时，产酯量则急剧下降，甚至不产酯。而对于少数酵母，如球拟酵母在35℃培养时，能保持最高的产酯量，但产酯能力也相对较弱。［7］
四川省食品发酵工业研究设计院名优酒研究中心李国红，以麦芽汁、豆芽汁、高粱复合液、酒糟复合液为产酯培养基进行对比研究，认为高粱复合液最适合产酯。玉米或高粱的黑曲糖化液及大米的黄曲糖化液分别培养产酯酵母时，则玉米糖化液的产酯量最高，高粱［8］糖化液次之，大米糖化液的产酯量最低。鲁勇比较了米曲汁、麦芽汁、豆芽汁对产酯的影响，认为米曲汁是最适产酯培养基。笔者也曾做过相关研究，以高粱、玉米、小麦、大麦、大米糖化液进行研究，结果显示，小麦糖化液是最佳的产酯培养基。对于这个现象，笔者认为是因为不同地区的菌株存在差异，以及不同地区的淀粉质原料的营养成分不同所造成的。
培养基含有一定量的酒精及有机酸类成分，对产酯酵母的产酯具有明显的作用，因为酒精和有机酸是合成酯的底物。但酒精含量也不能太高，太高会抑制酵母的生长，一般含量在2%～4%最佳。乙酸含量以0.12%为宜。若添加量过多，则效果适得其反。
培养基中添加一定量的磷盐，对产酯酵母的产酯有利。因为磷盐对酵母的生长及代谢均极为重要，产酯酵母也不例外。若在米曲汁培养基中添加0.1%的KHPO，将产酯酵母在30℃下培养72h，则酵母24细胞数、产酸量及产酯量均高于对照样。
pH值在4～5的范围内是最适合产酯的。在培养基接近中性时，产酯酵母生成乙酸乙酯的能力不但会下降，而且还能将已生成的酯迅速分解。因此，保持培养基较低的pH值，是完全必要的。
酒精酵母在生长繁殖时需要氧气，但在发酵生成酒精等成分时则无须供氧。而产酯酵母则在繁殖及产酯时均需要一定量的氧气，在进行液态静置培养时往往在培养液表面形成产酯酵母的菌膜，故又名产膜酵母。这是上述两种酵母不同的生理特性之一。但无论是液态或固态培养产酯酵母，其供氧量都不宜过大，否则均会阻止产酯作用的进行。普遍认为，产酯酵母在产酯的同时也在进行酯的分解，如果通气量过大，则会导致酯的分解速度过快，从而积累的酯也会少。主要原因是，供氧过多，产酯酵母的氧化作用加强，更多的中间代谢产物进入TCA循环，被氧化分解。而供氧少一是不利于菌体生长，二是醇类等厌氧产物增多，必要的有机酸类减少，这样酯的产量也相对减少。
因为产酯酵母生成酯的同时也在进行着酯的分解，因此，培养时间应该以酯的积累量最大的时候为宜。同时，还应该考虑到营养物质的利用和设备的使用周期。大多数研究表明，产酯酵母在培养4～5天的时候酯的积累量达到最大。在培养基中加入玻璃丝，接入产酯酵母进行培养，则对产酯有一定的促进作用，这说明产酯酵母不但适于液态培养，也适于半固态和固态培养。（三）产酯酵母的应用
在白酒的生产中，产酯酵母产生的乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等可以增加酒香。在醋的生产中，加入产酯酵母可以大量产生醛、醇、酸、酮、酯等物质。在果汁饮料生产中，应用产酯酵母可以产生多种芳香物质。选育产酯酵母来酿造葡萄酒，其香味有很大的提高。在香料生产过程中，应用产酯酵母能够生成多种芳香族化合物形成复合香。
从20世纪60年代初，产酯酵母就应用到了白酒生产过程中，填补了白酒的后味较淡和缺乏香气的不足。产酯酵母不光可以液态培养，同样可以用半固态培养，当静置液体培养时，培养液表面会出现一层菌膜，所以产酯酵母又叫产膜酵母。在小曲酒的酿造过程中，乙酸乙酯主要是由微生物代谢产物的生化反应生成的，产酯类酵母是白酒生香重要的微生物菌群，存在于酒醅中的产酯酵母有汉逊酵母（异常汉逊酵母）、假丝酵母等，它们均有较强的产酯能力。在较低pH值时，产酯酵母可以合成乙酸乙酯，在此时生成的乙酸乙酯不会被降解，在25～30℃之间，尤其是28℃时产酯酵母生成的总酯含量会达到最高，当品温继续上升至37℃，产酯酵母的产酯能力就会骤然下降，因此，在较低温度下发酵生产白酒，对积累酯类物质是极为有利的。不同于酒精酵母，产酯酵母在生长繁殖阶段和产酯过程中都对氧有需求，但供氧量不宜过大，否则会对酯的产量有影响。根据培养器的大小，培养产酯酵母的时间会改变，28～30℃液态培养时，锥形瓶培养时间是24～26h，然而卡氏罐培养时间是20～24h。而生香活性干酵母（ADY）使用前，必须先在35～40℃的水浴中放置20～120min进行活化。此外，ADY具备增乙（乙酸乙酯）降乳（乳酸乙酯）的功能，不仅能够增加酒质和提高出酒率，还对酒的香味有影响，促进酒香协调。
在清香型小曲酒的生产工艺中，对产酯酵母进行扩大培养，对产出的小曲酒进行质量检测，发现小曲酒中乳酸乙酯含量下降了［9］109.42%，并且酒质还得到很大程度的提升。方心芳教授也曾指出：“如果在己酸发酵液中添加乙醇和产酯酵母，则大量己酸乙酯会合成。”己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味成分之一，利用固定化技术将己酸菌和产酯酵母培养在一起，能够促进己酸乙酯的合成［10］。四川省食品发酵设计研究院、沱牌曲酒厂和仙潭酒厂进行了联合实验，将产酯酵母、窖泥和窖泥功能菌以特定的比例和方式应用［11］到浓香型白酒的生产中，取得了理想的效果。将产酯酵母和河内白曲相结合，制成的曲不仅具有较强的糖化发酵能力，还具备生香能力，用红曲、酿酒酵母Y001和生香酵母Y005的培养液生产白酒，大幅度提高了酒中乙酸乙酯的含量，生产出的酒的口味和香气都有明［12］显提高。
李国红认为产酯酵母应用在浓香型、清香型、小曲酒的生产上是完全值得推广的技术，具有投资小、见效快、保证产品质量的特点，［13］特别是与相应的配套工艺共同实施，会取得更加好的效果。沈怡芳提出在白酒生产中加入产酯酵母对酒体的风味有很大的作用。黄东红等选取玉米、黄豆、大米、芝麻和薄荷、丁香、檀香等材料生产小曲酒，在发酵过程中添加产酯酵母和云南白药，使用小曲酒的工艺混合发酵，通过蒸馏得到糟香调酒液，将糟香调酒液应用到白酒的调酒环节，调出的小曲酒具有糟烧酒的典型风味，醇厚甜净，后味绵长。
目前，产酯酵母普遍应用于小曲白酒的生产中，不仅增加了小曲酒中乙酸乙酯的含量，丰富了酒的香型，还有力地提高了小曲酒的优质产品率。二、酿酒酵母
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）属酵母属，是酵母中最重要、应用最广泛的一类，在发酵、功能性营养源和生物领域都有着重要的作用。酿酒酵母一般呈球形或卵形，直径5～10μm，无真菌丝，细胞通过重复的出芽繁殖，有些细胞发育为子囊，含1～4个子囊孢子的子囊菌。酿酒酵母菌体中富含β-葡聚糖和甘露寡糖等活性多糖、蛋白质、谷胱甘肽等活性小肽、核酸、氨基酸、维生素等营养功能成分，这些营养物质被不断地研究开发并应用于医药、功能食品和饲料等多个行业。
酿酒酵母菌含丰富的蛋白质、维生素、矿物质、多糖和许多生物活性物质，有许多完整的酶系，并含有2.5%～10%的核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）。这些营养功能成分对机体的免疫、抗肿瘤、抗氧化和消化功能等有重要作用，是维持机体健康的重要成分。目前，对于这些功能物质对人体、动物的作用及机制，人们一直在进行不断的研究并开发应用。酿酒酵母的细胞壁含有丰富的β-1，3-葡聚糖和甘露寡糖（mannan oligosaccharide，MOS），其含量可达到细胞壁干重的95%左右，两者在促进机体生长、提高免疫、增强非特异性免疫等诸多方面发挥着重要的作用。
β-葡聚糖是通过β-1，3/1，6糖苷键的方式结合形成的一种结构多糖，位于酵母细胞壁的内层，占细胞壁干重的30%～60%。β-葡聚糖在食品工业得到广泛应用，并具有刺激免疫、降低血胆固醇、抗肿瘤和预防炭疽热等显著的医学功效；此外，β-葡聚糖在增强溶菌酶活［14］性、补体活性和杀菌活性方面均具有显著的作用。TORELLO等［15］的研究结果表明，口服β-1，3-D-葡聚糖可促进释放生物活性的细胞因子，从而产生骨髓免疫活性，增强荷瘤小鼠的抵抗力。在β-葡聚糖功能作用的基础上，对其组分性状进行改良和对其进行降解，可改善物化性质和生物活性，拓宽β-葡聚糖的应用范围。
酿酒酵母中含超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），SOD可催化超氧阴离子的歧化反应，消除超氧阴离子的毒性，对机［16］体具有保护作用。王克文利用梯度溶氧方法定向地诱导细胞产生SOD，使天然酵母的SOD含量明显提高。此外，酿酒酵母菌体中还含有海藻糖、维生素、矿物质和三磷酸腺苷等营养和功能成分，这些成分也在不断地进行研究利用中。
酿酒酵母作为一类真菌，在发酵食品中应用广泛；作为真核生物的模式生物，在生物领域也有重要作用。酿酒酵母菌体培养技术现已成熟，但相关的营养功能物质利用率不高，生产、提取纯化技术也有待进一步改善，且相关产品的市场价格较高；酿酒酵母菌体中其他的一些营养功能物质的研究成果还不太成熟。随着相关营养功能物质的应用范围及用量越来越大，需加大对酿酒酵母及相关的营养功能成分的研究及提高产品的生产技术；通过优化发酵条件以及改善现代高效分离技术，从酿酒酵母中开发出价廉、高效、安全的营养功能物质并应用于食品与健康产业以及医疗等领域，都有待进一步研究。第二节 酵母的筛选一、高产乙酸乙酯酵母的筛选
在清香型小曲白酒的所有酯类物质中，乙酸乙酯的含量是最高的。清香型小曲白酒与大曲清香、麸曲清香不一样的是有突出优雅的“糟香”味。乙酸乙酯、乳酸乙酯、高级醇是构成清香型小曲酒的主体香成分。
白酒中的酯类形成有两种形式：一是醇和酸酯化形成；二是产酯酵母代谢产生，尤其是乙酸乙酯，白酒中的乙酸乙酯一般认为是由产酯酵母发酵产生的。而清香型小曲白酒的发酵周期短，酯的形成主要靠酵母。因此，选育出高产乙酸乙酯并适合白酒生产的酵母菌株是提高清香型小曲白酒酒质的关键。（一）试验材料
1.材料
清香型小曲白酒酿酒用曲：从湖北各酒厂收集得到。
2.培养基
液体YEPD培养基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。
固体YEPD培养基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，琼脂2%。
产酯培养基：葡萄糖8%，酵母膏1%，蛋白胨2%。（二）试验方法
1.高产乙酸乙酯酵母的筛选（1）小曲中酵母菌株的分离纯化 采用传统平板稀释分离纯化［17］的方法，分离纯化小曲中的酵母菌株。（2）高产乙酸乙酯酵母的筛选 将从小曲中分离纯化得到的酵母菌株活化培养24h，之后接种于产酯培养基，装瓶量为250mL锥形瓶装产酯培养基100mL，在30℃静置培养4天。然后将发酵液加入80mL酒精，并蒸馏接取馏液100mL，对馏液进行总酯和乙酸乙酯的测定。
2.高产乙酸乙酯酵母的耐受性研究（1）酒精耐受性试验 于150mL锥形瓶中分别装42mL、43mL、44mL、45mL、46mL YEPD液体培养基，灭菌后再对应加入无水乙醇0mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL，使培养基酒精含量分别为0%、6%、8%、10%、12%、14%。将菌株接入，30℃、120r/min振荡培养24h后，测定600nm波长下的吸光度，浓度大的菌液可以做适当稀释，使其吸光度在0.10～0.65以内，经稀释后测得的吸光度乘以稀释倍数，即为培养液实际的吸光度。（2）热耐受性试验 于150mL锥形瓶中装适量YEPD液体培养基，接入菌种，分别置于36℃、37℃、38℃、39℃、40℃下120r/min振荡培养24h后，测定600nm波长下的吸光度，考察其耐热能力。（3）耐酸性试验 用1mol/L盐酸调节培养基pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0。接入菌种，30℃、120r/min振荡培养24h后，测定600nm波长下的吸光度，考察其耐酸能力。
3.高产乙酸乙酯酵母的产物分析
将酵母发酵产物离心过滤处理后，进行气相色谱分析。同时，将含8种酯的标准溶液在相同气相色谱条件下做气相色谱。对照两者的色谱图分析其代谢产物。
4.高产乙酸乙酯酵母的鉴定（1）酵母总DNA的提取 采用天根生化科技（北京）有限公司生产的酵母基因组提取试剂盒进行提取。（2）酵母26S rDNA的扩增 50μL扩增体系为：Taq 0.25μL、缓冲液5μL、dNTP 4μL、模板1μL、正向引物1μL、反向引物1μL，用水补足体系。
正向引物序列为：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'。
反向引物序列为：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，48℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃温育10min，12℃ 10min。
电泳条件：取5μL DNA样品与2μL Sybr染色液混合，点样于0.7%琼脂糖凝胶上，缓冲液为1倍TAE，用2000DLMaker作为分子大小参照物，电压120V，时间20min。（3）酵母26S rDNA扩增片段的回收 采用天根生化科技（北京）有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。（4）酵母26S rDNA的测序 由北京六合华大基因科技股份有限公司测定。
5.总酯的测定
采用皂化回流法测定总酯，总酯含量按乙酸乙酯计。准确吸取蒸馏后的发酵液样品50mL于250mL具塞锥形瓶中，加入酚酞指示剂2滴，以0.1mol/L NaOH标准溶液中和游离酸，使溶液恰好变为微红色。
再准确加入0.1mol/L NaOH标准溶液25mL，若发酵液总酯含量高时，适当增加NaOH标准溶液的加入量。安装回流冷凝管，在沸水浴上回流30min进行皂化。应从溶液沸腾后，自冷凝管滴下第1滴冷却液起计时。回流完成后用0.1mol/L 1/2HSO标准溶液进行反滴定，24使微红色刚好完全消失为其终点，并记录HSO标准溶液消耗体积24V。用40%无酯酒精代替样品按上述步骤做空白试验，并记录HSO124标准溶液消耗体积V。计算公式如下：2式中 X——样品中总酯的质量浓度（以乙酸乙酯计），g/L；
c——硫酸标准滴定溶液的实际浓度，mol/L；
V——发酵液样品消耗硫酸标准滴定溶液的体积，mL；2
V——空白试验样品消耗硫酸标准滴定溶液的体积，mL；1
88——乙酸乙酯的摩尔质量，g/mol［M（CHCOOCH）=88g/325mol］；
50.0——吸取样品的体积，mL。
6.乙酸乙酯、乳酸乙酯、杂醇油的测量
乙酸乙酯、乳酸乙酯、杂醇油的测量采用气相色谱法，色谱条件如下：气相色谱仪为惠普5890SⅡ；FID检测器；色谱柱为HP-INNOWax交联石英毛细管柱；检测器温度260℃；进样口温度250℃；内标物为乙酸正戊酯。升温程序：50℃保持3min，之后以10℃/min升温至100℃，再以30℃/min升温至220℃并保持1min。空气流量300mL/min，氢气流量20mL/min，氮气流量20mL/min；分流比1/30；柱流量1mL/min；进样量1μL。
7.发酵液乙酸乙酯的测定
将发酵液离心及微孔滤膜过滤处理后，用气相色谱法测定乙酸乙酯含量。色谱条件：气相色谱仪为惠普5890SⅡ；FID检测器；色谱柱为HP-INNOWax交联石英毛细管柱；检测器温度260℃，进样口温度250℃；内标物为乙酸正戊酯。升温程序：50℃保持3min，之后以10℃/min升温至100℃，再以40℃/min升温至220℃并保持1min。空气流量300mL/min，氢气流量30mL/min，氮气流量20mL/min；分流比1/30。（三）结果与分析
1.高产乙酸乙酯酵母的筛选
从小曲中共分离纯化得到17株酵母菌株，将分离纯化得到的17株酵母菌株活化后接种到产酯培养液后，发酵产物经过离心及微孔滤膜过滤处理后进行气相色谱检测并分析乙酸乙酯产量，皂化回流法测总酯。筛选的结果见表2-1。表2-1 高产乙酸乙酯酵母的筛选
由表2-1可知，大部分酵母菌株能够产乙酸乙酯，但Y2和Y14两株菌株完全不产乙酸乙酯。各种酵母产乙酸乙酯量占总酯的比例也不相同，说明不同酵母产酯种类和数量也有一定的差别。而Y1菌株产乙酸乙酯最高，为2.152g/L，占总酯量的90.9%，其乙酸乙酯和总酯产量都远远高于其他菌株。因此，选用Y1菌株作为出发菌株进行后续研究。菌种Y1的菌落和菌体形态见图2-1和图2-2。图2-1 Y1菌落图图2-2 Y1菌体形态图（400倍）
从Y1菌落图（图2-1）可知，Y1菌落为白色、边缘整齐、较干燥、有脂质感。从Y1菌体的显微镜图片图2-2可以看出，Y1菌体呈椭圆形，且菌体中有液泡，是以一端出芽繁殖为主要繁殖方式的酵母菌。
2.高产乙酸乙酯酵母的耐受性研究
Y1对热、酸和酒精的耐受性见表2-2、表2-3、表2-4。白酒发酵过程中会产酸、产酒及温度升高。因此，发酵基质是一个酸性、高温及有一定酒精含量的环境。因此，需要对筛选出的高产乙酸乙酯酵母进行耐酸、耐温、耐酒精的考察，以此对菌株进行定向改造，达到选育出适合白酒生产的酵母菌株的目的。表2-2 不同温度下Y1菌株的生长情况表2-3 不同pH条件下Y1菌株的生长情况表2-4 不同酒精含量下Y1菌株的生长情况
由表2-2可知，酵母菌Y1在38℃下仍能有一定的生长量，在39℃、40℃菌株几乎没有生长。因此，该菌株的最高耐受温度为38℃。由表2-3可知，该菌株在pH值为2的情况下生长依然旺盛，可见该菌株的耐酸性能很好。其生长的最适初始pH值为4。酵母对酒精的耐受性除与自身生理有关外，还与环境参数、渗透压、发酵营养状况及酵母［18］原生质膜的组成和功能有关。由表2-4可知，随着培养基中酒精含量的提高，菌株的生长受抑制增大。在10%的酒精浓度下菌株有一定的生长量，在12%的酒精浓度下菌株几乎没有生长，因此，该菌的最高耐酒精度应该为10%。
3.高产乙酸乙酯酵母的产物分析［19］
不同的产酯酵母其代谢产酯的种类和产量都会不同，弄清楚其代谢产物酯的种类对指导产酯酵母的应用有一定的帮助。采用气相色谱可以对微量物质做简单的定性分析，由图2-4可知，八种酯的出峰时间（保留时间）为：乙酸乙酯1.058min，丁酸乙酯1.840min，乙酸正丁酯2.174min，乙酸异戊酯2.728min，乙酸正戊酯3.515min，己酸乙酯4.715min，庚酸乙酯8.075min，乳酸乙酯9.699min，对照图2-3可知，Y1酵母只产这八种酯中的一种，即乙酸乙酯。因此，Y1是一株很适合清香型小曲白酒酿造的酵母菌株。图2-3 Y1菌株产物色谱图图2-4 多种酯标准样品色谱图
4.酵母总DNA的提取
对筛选得到的高产乙酸乙酯酵母菌株Y1用天根生化科技（北京）有限公司生产的酵母基因组提取试剂盒提取其总DNA，并做琼脂糖凝胶电泳检测是否提取成功，其结果见图2-5。酵母是真核微生物，3［20］其基因组较大，一般达到12×10Mbp，因此，在凝胶电泳中对比Maker其DNA分子移动速度慢很多。由图2-5可知，所提取的Y1菌株总DNA条带亮度大，说明采用试剂盒提取酵母总DNA提取成功，且提取的酵母总DNA浓度大、产率高。图2-5 酵母总DNA电泳图A、B—酵母总DNA；M—DL2000
5.酵母26S rDNA的PCR扩增
采用分子生物学的方法鉴定酵母菌时，一般对其26S rDNA中的D1/D2区域进行序列分析，因为这一区域序列可以将绝大部分种区分［21］开，且种内菌株间的碱基差异小于1%。因此，本试验对26S rDNA中的D1/D2区域进行PCR扩增，来分析其序列对其进行鉴定。Y1酵母26S rDNA PCR扩增产物电泳图见图2-6。
由图2-6可知，Y1酵母DNA扩增成功，所扩增得到的片段的电泳条带亮度大，无拖尾，无任何非特异性扩增带。通过与Maker的对比，可以知道扩增得到的DNA分子大小在500～750bp之间。因此，扩增所得到的片段为26S rDNA的D1/D2区。图2-6 Y1酵母26S rDNA PCR产物电泳图M—DL2000；C、D—Y1酵母26S rDNA PCR扩增产物
6.酵母26S rDNA扩增片段的回收
为了提高扩增片段的纯度，以利于测序，对扩增得到的26S rDNA分子片段进行切胶回收，回收后的溶液再次做凝胶电泳，以证明回收成功，回收后的Y1酵母26S rDNA片段电泳图见图2-7。图2-7 Y1酵母26S rDNA回收电泳图E—回收后的26S rDNA片段；M—DL2000
由图2-7可知，Y1酵母扩增片段回收成功，且回收后的DNA电泳条带亮度大、无拖尾，说明回收的DNA分子纯度和浓度都很好，可以用于测序。
7.鉴定结果
通过测序得知扩增的DNA片段分子大小为590bp，且测序结果如下：
CACACTGCATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTAGCACCTTCGGTGTTCGAGTTGTAATTTGAAGATGGTAACCTTGGGTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGATGAGATGCCCATTCCTATGTAAGGTGCTATCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTAGATCAGACTTGGTGTTTTACGATTATCTTCTCTTCTTGAGCTGTGCACTCGTATTTCACTGGGCCAGCATCGATTCGGATGGCAAGATAATGGCAGTTGAATGTGGCTTCACTTCGGTGGAGTGTTATAGCTTCTGCTGATATTGCCTGTCTGGATCGAGGGCTGCGTCTTTTGACTAGGATGCTGGCGTAATGATCTAATGCCGCCCGTCTTGAACCGGGAACCACA
将获得的序列通过BLAST在核酸序列数据库中进行同源序列搜索及相关信息检索，结果如图2-8、图2-9所示。图2-8 序列匹配结果A图2-9 序列匹配结果B
由图2-8、图2-9可知，与该序列相似度达99%的菌株有很多株，同时结合VITEK-32全自动微生物菌种鉴定仪的鉴定结果，确定该酵母菌株为异常汉逊酵母（Hansenula anomala）。（四）小结
从酿造用小曲中分离筛选得到1株高产乙酸乙酯酵母菌株Y1，该菌株在产酯培养基（葡萄糖8%，酵母膏1%，蛋白胨2%）中30℃静置培养4天，产乙酸乙酯和总酯分别为2.152g/L和2.368g/L，乙酸乙酯产量占总酯的90.9%。
该菌株Y1的最高耐受温度为38℃，最高耐受酒精度为10%，耐酸性能良好，在pH 2的条件下依然生长很好，最适生长初始pH值为4。
通过分子生物学方法对Y1菌株26S rDNA进行鉴定，并结合VITEK-32全自动微生物菌种鉴定仪的鉴定，确认该酵母菌株Y1为异常汉逊酵母（Hansenula anomala）。二、酿酒酵母的筛选及特性研究
柑橘不仅味道鲜美，而且具有很高的营养价值。据测定，柑橘果肉含蛋白质、脂肪、糖、钙、磷、铁以及苹果酸、柠檬酸等有机酸类营养成分，而且富含维生素，它含有的维生素C是苹果的7倍、梨的10倍。
我国柑橘年产量达到1000万吨，为世界柑橘总产量的11.79%，仅次于美国和巴西，居世界第三。但在柑橘加工方面水平不高，远远低于33%的世界总体水平。柑橘易腐烂，无有效的保鲜措施，利用其作原料酿造柑橘酒是一种有效的方法。为了获得合适的酿造柑橘酒的酵母，使其充分适应柑橘汁的原料特点，作者从柑橘汁自然发酵液中筛选适宜的菌株，获得1株适宜柑橘酒发酵的酵母GJ-17，并对其进行了特性研究。（一）实验材料
1.材料
柑橘：购于武汉市农贸市场。
菌株分离源：武汉市武南郊区草莓园土壤。
对照菌株DV10：上海杰免工贸有限公司。
蔗糖：食用级，市售。
柠檬酸：分析纯，上海试剂一厂。
2.培养基
活化培养基：完全培养基（琼脂2%，蔗糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%，自然pH）。
增殖培养基：将成熟柑橘去皮除核榨汁，装入无菌锥形瓶中，按30μg/mL和100μg/mL添加链霉素、青霉素，加入4%（体积分数）乙醇，用柠檬酸调节pH值为3.2～3.8。
分离平板培养基：完全培养基（琼脂2%，蔗糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%，自然pH）。
种子培养基：柑橘汁（可溶性固形物含量Tss为8%～10%），加蔗糖调Tss为15%，调pH值为3.2～3.8，于115℃灭菌15min备用。
发酵培养基：柑橘汁可溶性固形物含量Tss为8%～10%，加蔗糖调Tss为15%，调pH值为3.2～3.8，添加有效量为50%的NaSO使225SO含量为100mg/L，于115℃灭菌15min备用。2
酵母菌性能测定培养基：完全液体培养基。（二）实验方法
1.柑橘汁中酵母的增殖培养及分离
将成熟柑橘去皮除核榨汁，装入2个无菌锥形瓶，其中一瓶加入
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