作者：罗荣城 李爱民
出版社：人民卫生出版社
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肿瘤生物治疗学(第2版)试读：
前言
由于环境污染和人口老龄化等因素的影响,肿瘤发病率越来越高,肿瘤已成为影响人类身体健康的最重要的疾病之一,如何更好地应用现有的技术、方法和诊疗手段防治肿瘤已成为医务工作者的重要任务。从19世纪90年代以细菌产物为基础制作的首例肿瘤疫苗,到20世纪70～80年代对抗体及细胞因子治疗的积极探索,随后90年代小分子靶向药物的临床使用,再到2010年FDA首次批准的针对前列腺癌的细胞免疫疗法,经历百余年的发展与进步,生物治疗在肿瘤治疗中发挥了巨大的作用,已成功应用于前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肾癌、肠癌等绝大部分肿瘤的治疗,显著地提高了患者的生存时间和生活质量,并成为继手术、化疗、放疗后的第四大肿瘤治疗模式。
为了让临床医、护、技人员更快、更好、更全面地掌握生物治疗的技术、方法和药物,我们于2006年主编出版了第1版 《肿瘤生物治疗学》。《肿瘤生物治疗学》出版后,大量读者向我们反映书稿在他们的临床和研究工作中有较好的参考价值,很多朋友也给予不少的鼓励,让我们认识到 《肿瘤生物治疗学》书稿的发表可以给大家提供一些帮助,对肿瘤防治起到一定的作用,这些反馈意见和建议都让我们深受鼓舞。
近年来,随着人们对机体抗肿瘤免疫应答及肿瘤免疫逃逸机制的认识不断深入,以免疫细胞、分子、基因为基础的干预手段应用于肿瘤治疗成为重大热点,肿瘤疫苗、抗T淋巴细胞活化抑制因子抗体、基因修饰的T淋巴细胞等已在临床应用中取得令人振奋的临床结果,生物治疗出现了日新月异的发展。这些成绩的取得,赋予了生物治疗新的内涵,2013年12月Science杂志将肿瘤免疫疗法作为2013年十大值得关注的科学领域之一。第1版 《肿瘤生物治疗学》的内容已经不能包含近几年来生物治疗取得的新成果,生物治疗的最新进展、临床应用的新原则、生物治疗如何与传统治疗手段的合理联合等内容也需要进一步明确与清晰阐述。
因此,我们组织一批医疗、教学、科研第一线的专家学者,还有部分初出茅庐而又才华横溢的青年才俊,编写了新版的 《肿瘤生物治疗学》,在旧版的基础上做了很多的更新和补充。书稿经过3次大的修改,部分章节修改了10余次,多位在国内外肿瘤学术界享有盛名的专家教授直接参与和指导了本书的编写,使本书更具科学性、权威性和实用性。孙燕院士和曹雪涛院士在百忙之中为本书作序,更给了我们极大的鼓舞。在此向各位的辛勤付出表示衷心感谢。
本书总共三十九章,分为三部分内容:前两部分为总论内容,概述了肿瘤生物治疗学的基础,包括肿瘤生物治疗的概况及各种生物治疗技术的基本原理、方法、研究进展和应用原则。第三部分以临床肿瘤学为着眼点,详细介绍了肿瘤生物治疗学的临床应用。以具体病种为线索,综合生物治疗的最新进展,汇总生物治疗领域各种治疗手段的单独、联合应用及与传统治疗手段的联合,充分体现肿瘤多学科个体化综合治疗的原则。同时概述了肿瘤生物治疗过程中的护理问题及生物制品的质量控制,兼顾全面性和实用性,广泛实用于不同等级医院、不同科室、不同年资的医、护、技工作者,可为肿瘤临床治疗和基础研究提供一定的指导。
肿瘤的生物治疗发展迅速,新的进展层出不穷,在本书的编写过程中,编者们虽力求最新最全,但是由于时间和经验所限,难免疏漏和缺陷,敬请读者们谅解和指正。2015年7月于广州
第一篇 肿瘤生物治疗学基础第1章 肿瘤生物治疗学概论
肿瘤是严重危害人类生命的重大疾病之一,一个多世纪来,科学家们从未停止对肿瘤治疗的探索。伴随分子生物学技术和免疫实验技术的飞速发展和人们对肿瘤的病因、发病机制的深入认识,肿瘤生物治疗作为一种安全而有效的治疗手段,在肿瘤综合治疗中的作用越来越突出,已逐步发展为继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗方法。
肿瘤的生物治疗是指应用现代生物技术及其产品(小分子有机化合物、多肽、多糖、蛋白质、细胞、组织、基因等等)直接或间接地介导抑瘤和杀瘤效应的全新治疗方法。生物治疗的概念是在免疫治疗的基础上延伸而来,最初这两个概念几乎是等同的,因为免疫治疗本身是生物治疗的一部分。随着治疗手段、方法、治疗用制剂的不断扩展,免疫治疗已不能涵盖全部生物治疗的内容,因而人们开始更普遍地接受生物治疗的概念。1983年,美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute,NCI)规范了生物反应调节剂(biological responsemodifiers,BRM)的概念,意指所有能够改变机体的生物反应,从而达到抑制或治疗肿瘤效应的制剂及疗法,尽管此概念仍在使用,但生物治疗和免疫治疗的概念受到更普遍的认同。
最初有记载的生物治疗已有100多年的历史,从19世纪90年代Coley设计的以细菌产物为基础的首例肿瘤疫苗,到20世纪70～80年代对抗体治疗及细胞因子治疗手段的探索,再到2010年FDA首次批准的针对前列腺癌的细胞免疫疗法,肿瘤生物治疗取得长足的发展与进步。近二十多年来,由于细胞生物学、分子生物学、肿瘤免疫学、生物工程学等诸多理论研究的深入和生物工程技术的进展,以免疫细胞、分子、基因为基础的干预手段应用于肿瘤治疗成为肿瘤学家们关注的重大热点。目前肿瘤生物治疗已被成功应用于前列腺癌、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的治疗,显著延长了患者的生存,提高了患者的生存质量。因此,生物治疗已成为继手术、化疗、放疗三大传统疗法之后的又一支柱性治疗手段。
生物治疗的涵盖面甚广,大致包括以下领域:①非特异免疫刺激剂及BRMs的应用;②细胞因子的应用:IFN、TNF、IL-2、CSF等;③免疫效应细胞的应用:TIL、LAK、CIK、DC、CTL、NK、CAR-T等;④单克隆抗体治疗与抗体介导治疗;⑤肿瘤疫苗;⑥内分泌疗法;⑦抗肿瘤血管生成的治疗;⑧信号转导与抗肿瘤治疗:包括细胞表面CD分子、黏附分子、受体等;⑨细胞凋亡的干预治疗;⑩基因疗法:基因治疗、基因疫苗等;⑪生物支持治疗;ꆡꆡꆡ组织与细胞移植治疗等。第一节 生物治疗在肿瘤综合治疗中的地位
手术、化疗和放疗是经典的肿瘤治疗的三大支柱,之所以成为支柱治疗手段是因为它们各有所长,不能相互替代,是当时最有效的疗法和目前尚在应用的普及性疗法。但肿瘤基础研究与临床诊疗技术进展到今天,上述任何一项治疗过程几乎都离不开生物治疗的参与,生物治疗本身也成为了支柱性疗法。生物治疗与化疗同属系统性治疗的范围,但两者又有明显的区别:①治疗用药本质的不同:所有的化疗药物是化学药物,而生物治疗所用的是具有很强靶向性或BRM作用的生物药物,有些甚至本身是生物体内存在的生理物质。②化疗药物对肿瘤体现的作用是直接的,如肿瘤细胞生长抑制或细胞毒作用,而所有生物治疗药物大多是通过机体的免疫系统、信号转导系统或其他系统的间接作用实现的。③化疗药物无严格的肿瘤针对性,而生物治疗药物有较强的肿瘤组织或细胞针对性(根据具体药物的不同,其针对性强弱也有所不同)。虽然化疗药物对肿瘤细胞的毒性杀伤大于正常组织,但其理论依据多是组织代谢或分化特征决定的,并非药物本身决定的。但生物治疗对正常组织与肿瘤组织的甄别是生物药物的特性决定的。④从治疗的靶向性可以看到,通常生物治疗的副作用明显小于化学治疗,但多数生物治疗的效果在不同程度上依赖患者本身的生理与免疫基础。现今,生物治疗已经有机地融合于肿瘤综合治疗的实践中,成为其不可缺少的部分。而且,其治疗范围也远远超出了恶性肿瘤。
可以预见,随着人们对肿瘤发生学、病因学、免疫学、遗传学诸领域认识的进一步深化,生物治疗必将展示更广阔的前景和舞台,因为所有的治疗手段中,只有生物治疗具有严格的靶向性和病因指向性,这正是理想的疗法所追求的最终目标。鉴于肿瘤生物治疗所涉内容甚广,下面仅对目前临床应用最多、影响较大的一些治疗技术的基本原理、应用形式和限制因素作一简要介绍。第二节 生物治疗的理论和发展前景
目前在临床上开展的生物治疗绝大多数属于免疫治疗。免疫监督学说是免疫治疗的理论基础,该学说认为肿瘤的发生是肿瘤细胞在多种因素的作用下发生了本质性的变化,使本来的自我物质变成了非我物质,机体的免疫系统能够识别这种非我成分并激发特异性免疫反应,达到控制、消除肿瘤的目的。
尽管免疫监督学说在肿瘤的防治中的作用仍有不少争议,但有一点是明确的,那就是机体针对病原微生物感染的免疫反应在理论上与免疫监督学说相近,抗感染免疫反应能够加强抗肿瘤免疫是非常明确的;诸多动物实验和临床资料亦表明免疫监督学说有相当的合理性。
基于以上基本原理,所有免疫治疗的基本原则有二:一是免疫反应调节(免疫激动、免疫刺激和免疫修饰等);二是直接使用免疫相关细胞因子。至于免疫治疗范畴外的生物治疗,如内分泌(激素)治疗、凋亡诱导治疗、抗血管生成治疗等,其理论基础是该类生物药物能够通过受体、配体、信号转导分子等发挥作用,对细胞的生长、分化、激活、凋亡、耐药、转移等生物学行为产生影响,或产生间接的生物学效应,减缓、抑制肿瘤的发生与发展。一、免疫刺激剂
免疫刺激剂治疗是最早开展的肿瘤生物治疗,也是应用历史最悠久的疗法,这些制剂大部分源自病原微生物本身或其某些成分,如MBV(Coley混合菌苗)、BCG、OK-432等。临床实践表明,这些免疫刺激剂的应用的确起到了一定的治疗效果,尤其在早期肿瘤和局部性肿瘤患者。
免疫激动剂治疗的基本原理是免疫刺激,众多研究表明,虽然机体有免疫监督的功能,但在通常情况下,由于癌发展过程的渐进性、肿瘤抗原隐匿性和肿瘤免疫逃逸等因素,机体的抗癌免疫力远远没有抗微生物免疫那么迅速、那么强烈。因而,免疫激发是免疫反应的初始环节,在抗癌免疫中也是最重要的环节。免疫刺激剂的作用就是激发机体的免疫反应,从而同时达到加强抗癌免疫的目的。
免疫刺激剂在肿瘤治疗中多联合其他疗法一并使用,有报道其作用与化学治疗、放射治疗甚至术后治疗均有不同程度的协同效果。在化疗药物中,有些本身即有明确的免疫刺激效应,如6-巯基乙醇、长春碱、环磷酰胺等。环磷酰胺在大剂量使用时为化疗作用,但在小剂量时却是免疫刺激作用。
接触性过敏原是一大类免疫激动剂,其引发的迟发性变态反应是一种细胞免疫功能亢进造成的组织损伤。人们很早以前就利用接触性过敏原来治疗某些肿瘤,如鳞癌和基底细胞癌等,并确实取得了一定的治疗效果,以致该疗法应用很广。除皮肤、黏膜等表面组织的肿瘤外,还用于妇科的宫颈癌、阴道癌。有报道局部使用DNCB、5-FU在上述早期患者亦获得良好结果。过敏原直接应用在晚期肿瘤患者效果不佳,局部用药也会引起用药部位的明显不适。
BCG是一株减毒分枝杆菌(其提取物又名PPD),早于1921年主要用于结核病的免疫预防接种。20世纪70年代,BCG因其能诱发明显的迟发性变态反应才作为典型的非特异性免疫刺激剂用于肿瘤的治疗和辅助治疗。动物实验表明,BCG能延缓、减少化学物品、放射因素和致瘤病毒诱导的肿瘤发生。在基因型白血病和乳腺癌易发的动物亦能明确推迟肿瘤发生的时间。在移植瘤动物模型中,应用BCG能明显抑制肿瘤生长。一项随机临床试验发现,BCG瘤内注射与多柔比星瘤内注射的完全缓解率分别为70%∶34%,5年的无进展生存期为37%∶17%,基于此BCG在1990年通过FDA批准用于治疗浅表膀胱癌。Bassi等临床试验也得到相似的结果,现卡介苗仍作为膀胱原位癌的初治方案。
如同其他免疫刺激剂一样,BCG治疗肿瘤的原理大致有以下几个方面:①BCG相关抗原特异T细胞的激活所导致的旁观者杀伤效应;②巨噬细胞介导的慢性细胞毒作用也加强了旁观者杀伤效应;③淋巴细胞、巨噬细胞激活后释出的某些细胞因子具有抑瘤、杀瘤作用;④BCG在活化免疫系统的同时也进一步激活了单核-巨噬细胞系统,尤其是NK细胞系统的活化在肿瘤治疗中发挥重要作用;⑤被激活的免疫系统中也包括了肿瘤抗原特异的细胞与体液成分,这些组分可能处于反应低下、无反应性或免疫抑制状态。
实际上,由于最初的免疫刺激剂多为病原微生物或粗提物。其确切的免疫激发原理和环节是非常复杂的,但其基本点有三:①免疫增强作用而不是免疫抑制作用;②细胞免疫刺激为主,体液免疫刺激为辅;③所有免疫刺激剂本身不具备肿瘤抗原针对性,对不同肿瘤、不同部位肿瘤疗效的差别并非是肿瘤选择的结果。
研究认为,这类免疫刺激剂所诱发的免疫刺激效应处于免疫反应的初始阶段,所激活的机体免疫反应既包括细胞免疫也有体液免疫,所激活的免疫反应本身不具备肿瘤特异性,个体差异性大,治疗剂量和效果不易控制和评价,在目前开展的肿瘤生物治疗中较少应用。二、细胞因子
在生物治疗中应用最多的是细胞因子,细胞因子是一组细胞调节性蛋白的总称,由免疫效应细胞或其他体细胞产生,具有以下共同特征:通常是小分子多肽,常有不同程度的糖基化;对周边细胞或分泌因子的细胞本身发生作用;主要通过信号传递方式影响免疫反应,与免疫效应细胞的生长、分化、活化、移动有关;作用于相应的高亲和力受体;多数细胞因子的作用呈现多效性(pleiotropic)。细胞因子治疗肿瘤的作用机制主要是免疫激发作用和直接对肿瘤细胞的作用,由于患者多处于对肿瘤的低反应状态,多数细胞因子具有免疫刺激作用,如干扰素(IFN)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-12和集落刺激因子(CSF)等。这种免疫刺激是一种非特异的免疫激动,会引起整体免疫功能的加强,同时体内本来存在的肿瘤特异性免疫的组分也受到免疫激发作用,表现为特异性抗肿瘤免疫的加强,因而会在不同程度上显效。有些细胞因子呈现直接的抗肿瘤效应,如IFN、肿瘤坏死因子(TNF)等。20世纪80年代初,Guesada等用IFN治疗毛细胞性白血病,其有效率(CR+PR)竟高达90%以上。之后的临床研究表明,IFN对十多种肿瘤(包括实体瘤和血液肿瘤)有效,除毛细胞性白血病外,疗效显著的还有慢性粒细胞性白血病(CML)、恶性淋巴瘤、肾癌、恶性黑色素瘤等。然而,令人遗憾的是,IFN-α具有明显的剂量相关毒性,包括致命的肝毒性等。基于疗效与不良反应的考虑,IFN-α在治疗肿瘤患者的剂量选择方面仍需进一步的临床试验探究。这类因子通过直接作用于肿瘤细胞上的某些结构如受体、通道、表面分子产生不同的生物学效应,引起肿瘤细胞的生长抑制或杀伤。细胞因子的免疫调节作用通常无选择性,TNF则是一种直接的肿瘤细胞杀伤因子,可导致肿瘤细胞的坏死而对正常细胞几乎无损伤作用。由于细胞因子的免疫调节作用通常无选择性,所以可作为辅助治疗常规应用,但细胞因子对肿瘤的直接作用有明显的选择性。某种因子只对某种肿瘤或某几种肿瘤显效,对某些肿瘤则完全无效,这是基于每种肿瘤发生时涉及的基因不同,细胞生物学行为改变中涉及的分子有所不同所致。
IL-2最早作为一种免疫调节剂用于肿瘤的治疗,能有效地恢复机体的免疫功能。有研究表明,IL-2可以促进T细胞增殖,诱导生成LAK细胞,增强NK细胞的杀伤能力,进而发挥抗肿瘤作用。IL-2于1992年和1997年分别被FDA批准用于治疗肾癌和恶性黑色素瘤。Yang等在高剂量及低剂量IL-2治疗转移性肾癌患者的随机研究中发现,高剂量能产生更强的抗肿瘤活性,但同时带来更严重的毒性及死亡率。Su等报告IL-2联合生物化疗治疗转移性黑色素瘤,32.5%的患者能获得持久的临床反应。目前,IL-2抗肿瘤效果明确,需解决的问题是选择最佳的给药方式及给药剂量,以达到增强疗效、减少毒性的目的。三、过继免疫细胞治疗
过继免疫细胞治疗是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。该治疗方法仍是目前临床常规应用的方法,这类疗法的作用机制与细胞因子治疗相似,也包括了非特异性的免疫增强和特异性的免疫增强两个方面。自20世纪80年代以来已进行了大量研究,该疗法历经LAK、TIL、CD3AK、CIK、DC-CIK、EAAL、NK、CAR-T等发展阶段,其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。目前普遍认为肿瘤抗原特异性CTL是肿瘤靶向治疗最为理想的免疫效应细胞。总的来说,效应T细胞的产生主要依赖于特异性肿瘤抗原的刺激、细胞因子和共刺激分子的作用以及基因工程技术的应用等。
在各种肿瘤免疫治疗方法中,细胞免疫疗法因具有以下的优点而受到人们的重视,为近十多年肿瘤免疫治疗中十分活跃的研究领域:①免疫细胞在体外处理,可绕过体内肿瘤免疫障碍的种种限制,从而选择性地发挥抗肿瘤免疫反应。如TIL往往缺乏抗肿瘤效应,而在体外一定条件下培养一段时间后可恢复特异性抗肿瘤作用;在体外培养条件下,呈现肿瘤抗原耐受的免疫细胞可被逆转。②免疫细胞的活化及效应过程往往由一些细胞因子介导,而目前基因工程可大量克隆不同的细胞因子,也可大量克隆肿瘤抗原或多肽,这使得体外活化扩增大量的抗肿瘤免疫细胞更为方便可行。③免疫细胞的体外活化扩增可避免一些制剂体内大量应用带来的严重毒副作用,如:IL-2、TNF-α、IL-4、IL-7、IL-12等具有抗肿瘤作用,抗CD3单克隆抗体(Mab CD3)的体内应用可激活T淋巴细胞,但这些制剂由于其复杂的多种作用,在体内大量应用可导致严重的甚至致死性副作用,这也是这些因子难以被批准临床使用的重要原因,而在体外操作可避免这些副作用。④目前已能在体外大量扩增自体或异基因的抗肿瘤免疫细胞,其数量大于肿瘤疫苗在体内激活的效应细胞数,一些体外培养的免疫细胞已进入临床治疗。实验显示肿瘤疫苗在体内应用可增加体内的肿瘤特异性CTL数量,但到一定时候,体内的CTL到达平台期而不再增加,这主要是由于体内存在的特异性及非特异性免疫调节网络限制了CTL克隆的扩增。而在体外培养可突破此调节网络,大量扩增免疫效应细胞。
随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学的发展,尤其是肿瘤抗原的鉴定和合成、四聚体检测及分拣以及DC细胞的培养,使得能在体外成功地培养出大量的肿瘤特异性CTL细胞,真正开始了主动免疫和过继性免疫相结合的肿瘤特异性免疫治疗。一些新的肿瘤分子生物学技术和免疫监测指标的建立,使人们能较精确地评价肿瘤患者的肿瘤分子和细胞免疫功能的数量和质量变化,并能针对每个患者的实际情况,设计个体化细胞免疫治疗方案,也可用不同种类和数量的细胞协同治疗等,并可依据治疗后的机体肿瘤免疫反应来不断调整治疗方案。一些新的肿瘤分子生物学技术和免疫检测指标的建立,使人们能较精确地评价肿瘤患者的肿瘤分子和细胞免疫功能的数量和质量变化,并能针对每个患者的实际情况,设计个体化细胞免疫治疗方案,也可用不同种类和数量的细胞协同治疗,并依据治疗后的机体肿瘤免疫反应来不断调整治疗方案。随着对肿瘤免疫逃逸机制的不断了解,细胞免疫治疗将与传统的肿瘤治疗(手术,化、放疗)和新的治疗方法如基因治疗、抗血管生成治疗等相联合,在肿瘤治疗中发挥重要的作用。四、肿瘤的基因治疗
肿瘤的基因治疗是一个技术性的概念,凡是直接使用一段核苷酸序列或导入一段基因起到抑瘤或杀瘤作用的方法均为基因治疗。鉴于肿瘤的发生是肿瘤细胞本身基因变化和免疫监控机制失灵的双方面原因,肿瘤的基因治疗有直接作用于肿瘤细胞和间接作用于免疫活性细胞两大方向。应用基因方法改善造血或提高机体的抗癌免疫力,从概念上应在肿瘤辅助性生物治疗之列。
肿瘤基因治疗的依据有二:一是肿瘤是一种明确的基因性疾病 [某些基因功能的异常或(和)缺失];二是肿瘤的发生与机体的免疫功能密切相关。对前者而言,插入功能性基因以纠正突变基因的作用就可以改变细胞的生物学行为,对后者而言,任何通过基因手段增强免疫活性细胞的杀瘤作用的措施都可起到治疗效果。
肿瘤基因治疗的形式是导入基因的直接作用和基因表达产物的作用,基因治疗的直接作用限于反义核酸治疗,而绝大多数情况下的基因治疗是通过载体形式,导入能表达某一活性分子的功能性基因,利用该表达产物起到治疗作用。(一)反义核酸治疗
根据某些癌基因的DNA序列直接合成或生产与其互补的一段寡核苷酸序列,称之为反义核酸。众多癌基因的发现为肿瘤的反义核酸治疗提供了理论依据,尽管人的基因组有30亿对碱基,但如果一段单核苷酸的长度超过17个碱基时,基本上可以与基因组中独一无二的序列结合,因而我们可以像应用普通药物一样,给患者使用人工合成的核苷酸制剂。通常应用物理方法将反义核酸导入肿瘤细胞,其可与互补的癌基因结合,干扰该癌基因的翻译和以后的功能发挥,达到抑瘤、杀瘤的目的。该方法曾受到广泛关注,在动物实验中也确有效果,但其最主要的限制因素有三:一是核酸导入的方式是体内使用,在其到达并进入细胞之前受核酸酶降解的威胁甚大,虽有诸多研究试图改变核酸的结构以减少降解,但效果不太理想,因为改构后的核酸又遇到可溶性和与互补序列结合能力的问题。二是核酸的导入并无靶向性,体外细胞实验不涉及靶向性问题,但用于临床却是极大的难题。三是核酸进入细胞本身为一种物理现象,呈现随机性和无选择性;与靶基因结合的核酸仍有解离、降解发生,同时由于核酸本身并没有阻碍相关基因的转录,新的癌基因还会转录出来,而持续、高效率的导入反义核酸是非常困难的。(二)以载体形式介导的基因转导
这是绝大多数基因治疗的形式,载体的使用是为了提高基因导入的效率及提供基因的表达条件,即启动转录并翻译出功能蛋白。因为所有基因的表达需要以细胞为基础,目的基因必须导入目的细胞才能实现上述目的。目前应用最多的载体形式有病毒载体和质粒载体,如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒载体等,病毒与病毒载体有本质的区别,病毒载体是一种剔除了病毒的致病性和复制能力但又保留了其感染能力和基因插入空间的形式。为了制备方便,这种载体可借助于辅助病毒和特定的细胞得以复制与扩增。使用病毒载体的突出优点是利用其感染特性提高基因的导入效率,同时病毒载体本身带了启动子和插入基因,以便基因的整合与表达。它的主要缺陷是制备过程复杂,基因导入无明确的细胞选择性和本身具有的抗原性,易产生抗体反应。各种载体都有各自的特征,应根据所选目的基因的特点、基因作用的靶组织和治疗目的酌情选择。质粒形式的载体亦有若干种,分别适用于原核、真核细胞的不同的基因克隆,由于质粒本身不具备感染能力,必须借助理化方法将其导入细胞,所以导入效率较低。质粒形式的基因转导多用于体外的细胞实验研究,亦用于直接的组织内DNA注射。
肿瘤基因治疗的靶细胞主要有两大类,一是肿瘤细胞本身,二是免疫活性细胞。肿瘤免疫中识别障碍的主要因素是肿瘤细胞本身的免疫原性和抗原提呈效果,因而肿瘤细胞的导入基因可以是明确的肿瘤抗原或抗原多肽基因,可以是肿瘤细胞表达缺陷的B7分子基因,可以是抗原提呈必需的MHC分子基因,可以是与抗瘤有关的某些细胞因子基因和直接的抑癌基因等。所有这些基因转导都是为了增加直接的抗肿瘤作用或提高肿瘤的免疫原性以达到激发免疫识别的目的。
将功能性基因导入免疫活性细胞也是策略之一,如将IL-2基因转入淋巴细胞以增强其活性和生存能力;将TNF基因转入淋巴细胞以增强其抗肿瘤作用;将某一肿瘤细胞的受体基因导入免疫细胞以加强其免疫识别能力等均属此列,诸多研究表明,所有上述基因治疗措施都收到了一定的效果。
上述基因治疗的本意是在患者体内建立一个持久的 “小型药厂”,已有多种载体和疾病获准进行前期临床治疗研究。目前仍存在的问题是基因转导的靶向问题,转入基因的持续表达问题,载体的抗原性和安全性问题,这些会通过载体的不断优化和改进逐步得到解决,基因治疗会有更好的作为。五、肿瘤疫苗
提到疫苗,人们很自然想到的是用于传染病预防的各种疫苗,如破伤风疫苗、牛痘苗、流感疫苗、肝炎疫苗等,与预防传染病的疫苗不同的是肿瘤疫苗多数是在患者发病后使用的,因而又称治疗性疫苗。的确,肿瘤疫苗的概念和原理确是源于传染病免疫,“Vacca”一词源于拉丁,意为caw,即疫苗一词源于最早的牛痘苗。在一百多年以前,人们把对传染病有效的免疫预防试图移植到肿瘤治疗中来,并初步奠定了肿瘤免疫原性的概念,但真正地将肿瘤疫苗作为一种治疗形式还是近十几年来研究进展的结果。
应用肿瘤疫苗的本质是将某一抗原组分作用于生物体,从而激发机体对该抗原或抗原载体的免疫反应,这种抗原形式或抗原的载体形式即是疫苗。基因治疗中提到的将某一肿瘤抗原基因或抗原提呈的相关分子基因导入肿瘤细胞用作免疫治疗制剂,即是肿瘤基因工程疫苗。鉴于肿瘤发生机制中肿瘤抗原免疫识别是突出的薄弱环节,因而肿瘤疫苗的应用的确起到了一定的效果。
明确肿瘤的抗原成分并以恰当的形式提呈给免疫系统是肿瘤疫苗使用效果的关键所在,随着肿瘤分子生物学和分子免疫学的快速进展,对肿瘤抗原有了较多的认识,确定了一些肿瘤的相关抗原、特异抗原,为肿瘤疫苗打下了基础。同时在抗原提呈环节上的了解,也为肿瘤疫苗的制作方法和应用方式提供了理论依据。
肿瘤疫苗的形式有细胞性疫苗和可溶性抗原疫苗两大类。细胞性疫苗是将肿瘤细胞进行某些处理,灭活后直接作用于机体。早期由于对肿瘤抗原筛检和制备技术上的困难,肿瘤细胞疫苗主要是用自体或具有相同基因的肿瘤细胞经照射后回输给患者,尔后的处理方式主要是增加细胞的免疫原性,如可溶性抗原直接负荷,通过转基因方式在肿瘤细胞表达肿瘤抗原,导入某些免疫相关因子以加强抗原提呈等。细胞疫苗的优势在于制备相对简便,细胞性物质的免疫原性强,缺点是必须通过外科或一些特殊途径获得肿瘤细胞。可溶性抗原或多肽疫苗则是对上述障碍的补充,如已知某肿瘤的抗原成分,人们可以在体外通过基因工程的方法制备出该抗原或抗原多肽,与不同的佐剂联合应用达到免疫激发的目的。这种方法应用的前提是必须有已知明确的肿瘤抗原,再者这种可溶性疫苗免疫原性较弱,不能同时附加其他免疫刺激分子也是其不足之处。
近年来的一大热点领域是DC疫苗的出现,DC是树突状细胞的简称。DC本是免疫激发过程中的抗原提呈细胞,其丰富的MHC分子表达,丰富的共刺激分子的表达和极强的抗原捕捉能力使之成为关键的抗原提呈细胞。DC疫苗实际上是肿瘤细胞疫苗的一种替代形式,可以纠正肿瘤细胞本身抗原提呈分子缺陷导致的免疫耐受。由于DC细胞本身并不具备肿瘤抗原,所以所有的DC疫苗的最基本的制备方式是相关肿瘤抗原的负荷。我们可以将已知肿瘤抗原直接通过吸附、交联、捕捉等方法固定于DC细胞表面,也可以以转基因方式使DC细胞表达出某些肿瘤抗原,这样DC细胞就成了地道的抗原提呈细胞。目前,DC细胞疫苗也在多种疾病获准试用,并展现出较佳的应用前景,从理论上讲,DC疫苗较常规的肿瘤细胞疫苗有较多的优越性。
一种有效的疫苗可以引起体液与细胞的双重免疫反应,抗癌抗体能够通过信号转导方式抑制肿瘤生长或引起肿瘤细胞凋亡,亦可通过补体介导的细胞毒作用(CDC)杀伤肿瘤,还能够通过抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)杀伤肿瘤细胞。细胞免疫方面的T淋巴细胞,主要是+CD8淋巴细胞可以直接杀伤肿瘤细胞,发挥抗肿瘤免疫的主力军作用,+当然疫苗激发的CD4细胞除本身具备直接的肿瘤杀伤效能外,还在放大、活化整体免疫反应中起重要作用。
近年来,随着肿瘤药理学、分子生物学及免疫学等相关学科的快速发展和交叉渗透,伴随相关抗原、载体、佐剂的开发、免疫技术的进步,抗原/佐剂疫苗、全肿瘤细胞疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗、质粒(裸)脱氧核糖核酸(DNA)疫苗、多肽疫苗、病毒基因转移载体疫苗、树突细胞相关疫苗等各种形式的肿瘤疫苗相继开发并进入临床试验。肿瘤疫苗成为全球抗肿瘤研究的热点之一。目前,处于Ⅰ～Ⅱ期临床研究的肿瘤疫苗已近140个,其中以黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌疫苗最多,全球已有20多个肿瘤疫苗正在进行Ⅲ期临床研究。
尽管肿瘤疫苗的研究取得了很大进展,临床应用效果有所提高,但是疫苗的开发仍存在一系列的核心问题。目前仍有以下问题亟待解决:①缺乏特异性强的肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA);②难以进行有效性评价;③难以确定最大耐受剂量;④缺乏合适的临床Ⅲ期试验的临床终点;⑤需要调控被癌症扰乱的通路,激活被癌细胞抑制的免疫通路;⑥克服肿瘤的免疫逃避;⑦晚期患者免疫功能低下、个体差异性大、先期治疗带来的免疫抑制问题、免疫应答起效慢;⑧长期安全性等。因而,肿瘤疫苗要发展成为一个成熟的治疗体系尚任重道远。六、肿瘤的抗血管再生治疗
早在1836年Virchow就提出恶性肿瘤组织中血管的数目增多,血管发生卷曲和扩张并主要集中在肿瘤边缘的现象。1907年,Goldman发现血管围绕着肿瘤生长,提出肿瘤的生长依赖邻近的毛细血管。1945年Algire提出了 “肿瘤血管生成”和 “血管新生化”的概念。1968年,有学者提出肿瘤能产生弥散性血管生成物质促进新血管的生成。但是直到1971年Folkman开始对肿瘤血管生成的研究开始,有关血管生成的探索才取得了较大的进展,逐步形成了 “肿瘤生长和转移是血管依赖性”的观点。
血管生成(angiogenesis)又称为血管新生化(neovascularization),是指活体组织在已存在的微血管的基础上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程,有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成(vasculogenesis)。
在肿瘤生长的最初阶段,肿瘤细胞可以通过扩散的方式吸收营3养。但肿瘤的体积达到2～3mm时,由于缺乏足够的营养和氧气,其生长受到限制,此时肿瘤细胞的增殖和死亡达到平衡,肿瘤处于休眠状态,几乎不会发生转移,这种状态可能维持长达数年之久。此后,在某些因素(缺氧、癌基因)的诱导下,血管生成因子处于上调状态,并且(或者)血管生成抑制因子处于下调状态,打破了两者之间的动态平衡,使得血管生成机制处于开启状态,开始新血管生成的过程。新生血管为肿瘤的继续增殖提供了充足的氧气和营养物质,使肿瘤得以快速生长。
肿瘤内出现血管后,除了血管带给瘤细胞营养物外,内皮细胞本身对瘤细胞也有旁分泌刺激作用。肿瘤新生血管的旁分泌效应源于内皮细胞产生的生长因子和细胞因子,它们刺激肿瘤细胞生长和转移。内皮细胞产生的生长因子有bFGF、血小板源生长因子、胰岛素样生长因子(Ⅰ、Ⅱ)和细胞因子(如IL-2、IL-8、GM-CSF等)。
目前肿瘤的抗血管生成治疗主要通过两种途径发挥作用:①破坏新生血管,造成血栓阻止肿瘤的血液供应,使肿瘤细胞 “饿死”并减少肿瘤转移;②使肿瘤血管 “正常化”。抗肿瘤血管药物能够使得肿瘤血管及其微环境由原来的结构和功能的紊乱状态向正常状态转变,使得肿瘤细胞从乏氧状态中解脱出来,从而改善肿瘤的微环境,增加肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性。
贝伐珠单抗是第一个被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准通过抑制血管生成发挥抗癌作用的新药,于2004年2月26日上市作为结肠癌的一线用药。2005年9月重组人血管内皮抑素(恩度)得到中国食品药物管理局的批准上市。多种抗血管生成药物陆续在美国及其他国家上市。七、抗体与抗体介导的治疗
自1997年来,单克隆抗体药物的上市与临床应用为生物治疗竖起了一面旗帜。抗体及其介导的治疗有着最佳的理论基础:其一,抗体治疗是真正意义上的肿瘤分子靶向治疗,而目前普遍应用的免疫调节分子治疗、基因治疗、肿瘤疫苗等则多少有些间接治疗的概念,因为这些措施或是通过免疫调节增强抗肿瘤作用,或是通过基因转录并翻译出活性蛋白后间接抗肿瘤;二是抗体有极佳的靶组织特异性,这是任何其他方法无法比拟的。20世纪70至80年代人源性抗体制备技术上的限制影响了抗肿瘤单抗真正作用的发挥,随着抗体人源化技术的进步,抗体治疗的优势正逐步显现出来,已成为某些肿瘤治疗的不可缺少的手段。肿瘤是一种细胞性疾病,治疗方法中靶组织的针对性越强疗效越好,这是一个基本的常识。鉴于肿瘤发生过程中已有结构和生物行为上的变化,可以区别于正常组织,为抗体的特异治疗提供了前提条件。
目前认为单抗的作用机制有阻断作用、信号转导作用以及靶向作用等三种作用机制:①阻断作用:现用于临床的大部分未偶联单抗,主要用于自身免疫和免疫抑制,是通过阻断和调节作用完成的。几乎在所有的单抗应用中,通常都是通过阻断免疫系统的一种重要的胞质或受体-配体相互作用而实现的。另一种相类似的阻断活性可能存在于单抗的抗病毒感染中,通过阻断和抵消病原体的进入和扩散表现出对机体的防御功能,短期给予单抗后可取得长期疗效。②信号转导作用:许多抗癌单抗是通过恢复效应因子,直接启动信号机制而获得细胞毒效应的。在抗-Id的临床试验中,B细胞受体(BCR)与抗体的交联导致正常细胞和肿瘤细胞的生长受抑制和凋亡。对曲妥珠单抗(trastuzumab)而言,单抗结合可诱导一系列在肿瘤生长控制中起作用的信号传递,该抗原是生长因子受体家族的一个成员,能提供重要的有丝分裂信号,其单抗似乎能阻断与促进肿瘤生长有关的重要的配体-受体相互作用。③靶向作用:瘤细胞靶向单抗的首要目的是产生肿瘤特异性反应物,然后由免疫系统中的活化因子将其消灭,如早期抗-Id单抗在淋巴瘤中的应用。研究表明:利用单抗与化学药物、放射性核素以及毒素形成的偶联物具有对肿瘤细胞的选择性杀伤作用,同时具有更高的疗效,并且对耐药性肿瘤细胞也有杀伤作用。这些研究结果为应用抗体治疗肿瘤的可行性提供了重要依据。单克隆抗体用于抗肿瘤治疗有两种基本的方式,一是单抗的单独应用,二是用单抗与其他抗肿瘤活性物质进行偶联,进行免疫靶向治疗。这些研究结果为单克隆抗体应用于肿瘤治疗的可行性提供了重要依据。单克隆抗体用于抗肿瘤治疗有两种基本的方式,一是单抗的单独应用,二是用单抗与其他抗肿瘤活性物质进行偶联,进行免疫靶向治疗。单抗实际上是作为其他抗肿瘤物质的载体,将其特异地携运至肿瘤细胞而发挥抗肿瘤作用。此外,单抗也可在体外对骨髓进行预处理,使其净化,以便用于自体或同种异体骨髓移植。目前在进行临床前期试验的单抗药物有数十种之多,预计在短期内会为肿瘤生物治疗增添一批生力军。
抗体及其介导的治疗有极好的发展前景,目前主要的缺陷为:一是生物蛋白性药物的制备工艺要求复杂,成本甚高,对多数患者来说还是一个相当大的负担;二是抗体的有效性取决于靶抗原的特异性与表达状态,而肿瘤特异性抗原,高表达膜抗原在肿瘤中却甚为少见,使特异性抗体的开发非常困难;三是对多数肿瘤而言,肿瘤特异性抗原有个体化倾向,如此更增加了抗原筛选和制备的难度。一个领域的发展或突破,最主要的是取决于该领域相关关键技术的进步,相信随着研究的深入和相关技术的发展,会有更多疗效佳、经济性好的抗体药物出现在抗癌一线。八、肿瘤治疗中的生物支持疗法
生物支持疗法属于肿瘤辅助治疗的范围,但其在临床治疗中的地位却非常重要。目前在肿瘤治疗中生物治疗毕竟还处于次要地位,手术、放疗和化疗在多数情况下仍担任主要角色。鉴于放化疗方法几乎没有组织和细胞的选择性,治疗的同时也引起正常组织和细胞的损伤,尤其是最敏感的造血组织的损伤,没有生物支持的常规治疗很难达到彻底或根治的目的。此外,组织与细胞移植也是目前肿瘤治疗的一项重要手段,也属于生物支持治疗的范围。现阶段,在肿瘤治疗中没有生物支持措施的方案是难以想象的。生物支持治疗本身是一个很宽的领域,内容、技术都非常复杂,本文不展开讨论。
综上所述,肿瘤的临床诊断与相关治疗已有了长足的进展,为无数肿瘤患者延长了生命,提高了生存质量,这些也应同时归功于长期耕耘在肿瘤基础研究领域的众多科学工作者。我们相信随着基因组计划的实现,蛋白质组功能计划的实施及诸多科学领域的进步,对肿瘤的预防和诊疗还会有更光明的前景。(陈逢生 张湾 韩焕兴 罗荣城)参考文献
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